控制性肺膨脹對兔外源性肺損傷的療效及其機制探討

汪洋，劉曉偉，徐志鴻，張艷飛

（中國醫科大學附屬第一醫院急診科，沈陽 110001）

·論著·

控制性肺膨脹對兔外源性肺損傷的療效及其機制探討

汪洋，劉曉偉，徐志鴻，張艷飛

（中國醫科大學附屬第一醫院急診科，沈陽 110001）

目的探討控制性肺膨脹對外源性急性肺損傷動物模型肺保護作用及其機制。方法應用靜脈注射油酸成功復制外源性急性肺損傷模型，免疫組織化學方法檢測肺組織IL-10和IL-6蛋白表達；用ELISA雙抗夾心法檢測血清中IL-10和IL-6含量；Western blot檢測肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白表達；逆轉錄PCR測定肺組織中ICAM-1mRNA和SP-A mRNA表達；流式細胞儀定量分析肺組織細胞凋亡。結果35 cmH2O壓力維持20 s的肺復張方法能有效提高PaO2和PaO2/FiO2，降低PaCO2，改善氧合和肺順應性，對肺外源性急性肺損傷的復張效果良好；與對照組比較，控制性肺膨脹治療組肺組織和血清IL-10及IL-6含量明顯增高（P＜0.05），肺組織和肺泡灌洗液SP-A表達水平顯著減少（P＜0.05）；流式細胞儀檢測結果顯示，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05）。結論控制性肺膨脹可通過抑制凋亡，減輕急性肺損傷時的炎性反應，降低肺水腫程度，減少肺組織SP-A降解，促進肺泡SP-A合成與分泌，對外源性急性肺損傷的保護作用較好。

急性肺損傷；控制性肺膨脹；白介素6；白介素10；肺表面活性物；凋亡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的基礎病變，是多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）在肺臟的表現［1］，其本質是由各種原因直接或間接損傷肺毛細血管內皮細胞，導致內皮細胞功能障礙，肺毛細血管通透性增高的血管滲漏綜合征。ALI具有較高的致死率，屬于臨床重癥治療中的難點［2］。早期診斷、早期合理干預是降低ALI患者病死率的關鍵，機械通氣是重要的支持和治療手段，應用合理的機械通氣策略，可為肺損傷的緩解和恢復創造條件。

控制性肺膨脹（sustained inflation，SI）是一種肺復張方法，機械通氣時通過給予足夠的氣道壓力，使塌陷的肺泡充分復張，且屏氣一段時間，增加肺泡的穩定性，從而達到增加機體氧合的目的［3，4］。本研究應用控制性肺膨脹這一肺復張方法干預治療外源性ALI動物模型，采用免疫組織化學、流式細胞技術、免疫印記技術、基因逆轉錄擴增技術（RTPCR）等分別從動物臨床癥狀、肺組織形態、肺組織炎性細胞因子、細胞間黏附分子、肺表面活性物質的蛋白表達以及細胞凋亡等方面對SI肺保護作用及其機制進行多層次、多角度的對比研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用24只健康新西蘭兔，建立外源性ALI動物模型后將實驗動物隨機分為3組，每組8只。空白對照組（C組）：不做任何處理，僅觀察指標；ALI組（EP0組）：靜脈內注射油酸造成ALI；治療組（EP1組）：靜脈內注射油酸造成ALI后，采取SI（35 cmH2O、20 s）進行肺復張。

1.2 主要試劑及設備

組織總蛋白提取試劑盒購自天根生化科技公司，Western blot抗體購自英國ABCam，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購自美國Santa Cruz公司，凋亡試劑盒購自武漢華美生物工程公司，RNA提取Trizol試劑購自美國Gibco BRL公司，RNA酶抑制劑和逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物臨床觀測指標：記錄每組實驗動物造模前、后和基礎通氣30、60 min的下述指標：（1）氣體交換指標：動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、血pH；（2）呼吸力學指標：吸氣峰壓（peak inspiratory pressure，PIP）、氣道平臺壓力（plateau pressure，Pplat）、計算呼吸系統動態順應性（dynamic compliance，Cdyn）；（3）血流動力學指標：平均動脈壓力（mean artery pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）。

1.3.2 蛋白印記：取蛋白樣本，經變性、電泳、轉膜、一抗（1∶100稀釋）4℃孵育過夜、洗膜后二抗室溫孵育30 min，ECL發光，顯影。結果處理，以目的條帶與內參照β-actin的光密度比值作為目的基因相對表達量。

1.3.3 免疫組織化學方法檢測IL-10和IL-6蛋白表達：采用SP法，樣本10%甲醛溶液固定，常規制作組織蠟塊，石蠟切片，0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min，抗原修復，一抗（羊抗兔IL-10、IL-6 IgG多克隆抗體，1∶100），PBS清洗3次，每次5 min，分別滴加二抗（生物素標記羊抗兔IgG）工作液，37℃溫箱濕盒內孵育30 min；PBS清洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色2～5 min，自來水充分沖洗，終止顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。陰性對照用PBS替代一抗，其余步驟同上，光鏡觀察陽性細胞表達部位并照相。結果判定：（1）著色細胞占細胞計數百分率＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；（2）無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分；棕褐色為3分；（3）二者相乘即陽性等級。0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性。

1.3.4 逆轉錄PCR測定肺組織目的基因表達：總RNA提取，取肺組織0.1 g，剪碎后加人1 mL Trizol Reagent，用無菌注射器反復抽吸使之成乳狀，再用氯仿、異丙醇、酒精等處理后提取總RNA。在紫外分光光度下檢測波長在260、280 nm的吸光度值，計算提取物RNA濃度，判定其純度；反轉錄合成cDNA，在20 μL反轉錄反應體系中加入樣本RNA、2倍緩沖液、25 mmol/L硫酸鎂、寡核苷酸、RNA酶抑制劑、寡核苷酸引物和逆轉錄酶，混勻后65℃l min、30℃5 min、30 min勻速升溫至65℃30 min、98℃5 min、5℃5 min，其產物即cDNA；常規PCR擴增。

1.3.5 流式細胞儀分析細胞凋亡：單細胞懸液制備，Annexin Ⅴ-FITC+PI雙染，1 h內用流式細胞儀檢測，激發波長488 nm，雙參數分析綠熒光（Annexin Ⅴ標記的胞膜完整但外翻的細胞）及紅熒光（PI標記的胞膜破損細胞）MODFIT軟件分析細胞凋亡結果，結果以散點圖形式輸出。左上代表細胞碎片；右上代表壞死或凋亡晚期細胞；左下代表正常細胞；右下代表早期凋亡細胞。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 血氣分析、血流動力學指標

EP1組在各時間點（30、60 min）PaO2/FiO2和PaO2均明顯高于EP0組（P＜0.05），EP1組較EP0組改善更顯著；EP1組在機械通氣后60 min時PaCO2變化與EP0組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

機械通氣30、60 min時，EP1組HR變化與EP0組比較差異有統計學意義（P＜0.05），而MAP變化組間差異無統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 肺外源性ALI家兔血氣分析指標Tab.1 The blood gas analysis of rabbit with lung exogenous ALI

表2 肺外源性ALI家兔血流動力學指標變化Tab.2 Changes in hemodynamic indexes of rabbit with lung exogenous ALI

2.2 肺組織中IL-10、IL-6的變化

IL-10、IL-6陽性染色為棕黃色。C組、EP0組和EP1組肺組織中IL-10和IL-6均呈弱陽性表達，在肺泡上皮細胞、血管內皮細胞內可見微量棕黃色陽性顆粒（圖1、2）。

2.3 各組血清中IL-10、IL-6含量變化

與C組比較，EP0、EP1組血清中IL-10、IL-6含量均顯著增加（P＜0.05），而EP1組血清中IL-10含量低于EP0組（P＜0.05）。見表3。

圖2 各組肺組織中IL-6表達情況 免疫組化×200Fig.2 The expression of IL-6 in lung tissue of each group IHC×200

2.4 肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白和mRNA表達

與C組比較，EP0、EP1組肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白含量和mRNA表達均顯著減少；EP1組肺組織和肺泡灌洗液中SP-A蛋白含量和mRNA表達均明顯高于EP0組，見圖3。

表3 血清中IL-10、IL-6含量比較（pg/mL）Tab.3 Comparison of IL-10 and IL-6 content in serum（pg/mL）

圖3 肺組織和肺泡灌洗液SP-A蛋白及mRNA表達Fig.3 The expression of SP-A protein and mRNA in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid

2.5 肺組織細胞凋亡結果

經流式細胞儀檢測，C組、EP0組、EP1組肺組織細胞凋亡率分別為（14.56±1.67）%、（23.61± 2.58）%、（19.16±2.14）%。與C組比較，EP0、EP1組肺組織細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），EP0與EP1組間差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

急性肺損傷是一種臨床急危重癥，肺容積明顯減少且病變不均一是ALI的重要特征。國內外的研究資料顯示［5，6］，ALI主要以肺泡及肺間質水腫，大量肺泡萎陷且程度不均一為特點。ALI目前尚無簡單而可靠的診斷指標，仍根據臨床表現進行綜合判斷。ALI的發病機制尚未完全闡明，隨著科學及各項技術的發展，人類對于ALI的發病機制有了更深刻的認識，主要包括以下方面［7］：（1）炎性細胞因子的失衡；（2）細胞間黏附分子的參與；（3）肺表面活性物質（pulmonary surfactant，PS）系統的異常；（4）細胞凋亡等。

SI是近年來研究較多的機械通氣新策略，無論是動物實驗還是臨床研究均顯示對ALI/ARDS有良好的療效［8］。研究顯示，SI復張后肺容積明顯增加，提示SI能夠促進塌陷肺泡的復張［9］。還有研究結果顯示，SI的應用能夠顯著提高氧合，增加肺順應性、呼氣末肺容積以及功能殘氣量，減少機械通氣時的死腔量，減輕肺水腫與肺損傷程度，達到治療ALI的目的［10］。SI等肺泡復張手法能顯著改善氧合的原因在于：通過給予氣道較高的壓力，使較多的萎陷肺泡復張，改善肺內氣體分布，從而減少分流，改善了通氣/血流比例，使肺部氧合增加；SI持續一定的時間有助于時間常數不同的肺泡的氣體均勻分布，并且延長氣體交換時間，也增加肺部的氧合［11，12］。

本研究建立ALI動物模型，通過預實驗，選擇最適SI壓力（35 cmH2O 20 s）治療外源性ALI，實驗結果顯示，SI治療能有效改善動物血氣分析及血流動力學指標，為進一步闡明其治療機制，本研究從分子生物學水平及細胞水平揭示SI對炎性因子IL-10及IL-6、肺表面活性物SP-A以及細胞凋亡的影響。研究結果發現，ALI中存在著促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的平衡失調，而SI不僅可以抑制促炎細胞因子的含量，同時抑制抗炎細胞因子的分泌，有利于維持機體炎性反應的平衡，且對外源性ALI的作用更加明顯。ALI存在SP-A下調的現象，SI治療后動物肺組織及肺泡灌洗液中SP-A含量升高，表明實施SI對改善ALI引起的SP-A含量下降作用明顯。其原因為：SI治療可減輕肺組織炎性反應，降低肺水腫發生程度，使肺泡SP-A合成增加、降解減少，肺泡灌洗液及肺組織SP-A蛋白表達均增加。流式細胞儀分析結果發現SI可通過抑制ALI時異常增高的肺組織細胞凋亡，使肺組織炎性反應降低，肺臟損傷程度減弱。

綜上所述，SI可通過抑制凋亡，減輕ALI時的炎性反應，降低肺水腫程度，減輕AT-Ⅱ的損傷，減少肺組織SP-A降解，促進肺泡SP-A合成與分泌，維持AT-Ⅱ正常的結構與功能，從而發揮對外源性ALI保護作用。

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（編輯武玉欣）

Study of Sustained Inflation and Its Mechanism for Exogenous Acute Lung Injury Animal Models on
Lung Protection

WANG Yang，LIU Xiao-wei，XU Zhi-hong，ZHANGYan-fei

（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo evaluate the lung protective effect of sustained inflation（SI）and its mechanism for exogenous acute lung injury（ALI）animalmodels.MethodsExogenousacute lung injury animalmodelswere replicated using intravenous injection ofoleic acid.Immunohistochemistry and double antibody sandwich ELISA were carried out to detect IL-10 and IL-6 protein levels in lung tissues and serum.Western blot was used to detect the expression level of SP-A in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）.The expression of ICAM-1and SP-A mRNA in lung tissue was measured by reverse transcription PCR.The apoptosis of lung tissue cells was detected by flow cytometry.ResultsThe maintenance of 20 s lung recruitment method of 35 cmH2O pressure could improve PaO2and PaO2/FiO2，reduce PaCO2，and improve oxygenation and pulmonary compliance.The re-expansion effect of sustained inflation for exogenous acute lung injury was good.The IL-10 and IL-6 levels in lung tissue and serum for SI group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.The SP-A expression level of lung tissue and BALF in SI group was significantly reduced compared with the control group（P＜0.05）.Flow cytometry analysis showed that the apoptosis rate of SI group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.ConclusionSustained inflation played an important role in lung protection against exogenous ALI through inhibition of apoptosis，lightening of inflammatory response，reduction of pulmonary edema and SP-A degradation in lung tissue，as well as promotion of SP-A synthesis and secretion in pulmonary alveolus.

acute lung injury；sustained inflation；IL-10；IL-6；pulmonary surfactant；apoptosis

R655.3

A

0258-4646（2015）06-0498-05

遼寧省自然科學基金（201202284）

汪洋（1971-），男，副教授，博士. E-mail：wywxt2000@sohu.com

2015-01-14

網絡出版時間：