未足月胎膜早破患者外周血中分泌型磷脂酶A2的表達與羊膜腔感染的相關性

周洋，周佳任，徐漫飛，張怡舜，趙巖

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

·論著·

未足月胎膜早破患者外周血中分泌型磷脂酶A2的表達與羊膜腔感染的相關性

周洋，周佳任，徐漫飛，張怡舜，趙巖

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

目的研究外周血中分泌型磷脂酶A2（sPLA2）在未足月胎膜早破及羊膜腔感染中的作用及其意義。方法采用實時熒光定量PCR技術檢測30例未足月胎膜早破患者（實驗組）分娩發動前后、30例未發生胎膜早破的未足月正常妊娠患者（正常對照組）及30例足月胎膜早破患者（足月對照組）分娩發動后外周血中sPLA2mRNA的表達水平。未足月胎膜早破患者結束妊娠后取胎膜行病理學檢查，以確定有無組織學絨毛膜羊膜炎。結果未分娩發動時sPLA2mRNA的表達水平實驗組為1.079± 0.746，正常對照組為0.651±0.481，實驗組與同孕周正常對照組相比sPLA2mRNA的表達水平升高，差異有統計學意義（P= 0.011）。分娩發動時外周血中sPLA2mRNA的表達水平實驗組為2.439±0.086，足月對照組為2.575±0.036，實驗組與足月對照組相比sPLA2 mRNA的表達水平無統計學差異（P=0.787）。實驗組中分娩發動時sPLA2的含量與是否患絨毛膜羊膜炎有關（P=0.008）。結論sPLA2升高可能參與未足月胎膜早破的發病，并與羊膜腔的感染有關。

胎膜早破；分泌型磷脂酶A2；絨毛膜羊膜炎；分娩發動

分娩的發動是一個極其復雜的生理過程，是受多種因素綜合作用的結果。目前國內外有很多證據支持前列腺素在促進子宮收縮及啟動人類分娩方面起著核心作用［1］，分泌型磷脂酶A2（secretoryphospholipase A2，sPLA2）作為前列腺合成途徑中其中一步的限速酶，被證實在人類妊娠組織中表達。國內現有研究表明早產及足月臨產組血清中sPLA2含量均高于對照組，這些結果提示未足月或足月分娩發動時sPLA2表達上調可能是導致前列腺素合成增加的部分原因，并且sPLA2的表達增加可能與自發性胎膜早破有關［2］，但尚缺少相關研究及有力證據。最近的國外研究表明，使用反義寡核苷酸抑制sPLA2的表達及酶活性可以抑制前列腺素合成［3］，這為降低早產的發生率提供了新的治療技術干預，為預防早產的發生提供了新方向。胎膜早破是導致早產的重要原因之一，其中未足月胎膜早破（孕周小于37周的胎膜早破）對于新生兒圍產期患病率及死亡率的影響最大，而發生胎膜早破后是否出現羊膜腔感染對于新生兒及孕婦的預后均具有重要意義。國內現有關sPLA2與未足月胎膜早破及宮內感染相關性的研究較少。因此，本研究通過檢測未足月胎膜早破患者外周血中sPLA2 mRNA的水平，探討其在未足月胎膜早破中的表達及意義，評價高水平sPLA2對診斷未足月胎膜早破后宮內感染的可行性以及其能否作為預測宮內感染的指標，探討未足月胎膜早破分娩發動的可能機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月至11月在中國醫科大學附屬盛京醫院產科住院的患者共90例，將30例未足月胎膜早破患者（孕28～36周）編入實驗組，將與實驗組同期入院的30例未發生胎膜早破的孕28～36周的正常妊娠患者作為正常對照組（與實驗組比較孕周無統計學差異，P＞0.05），將30例足月胎膜早破患者（孕37～40周）作為足月對照組。采每位受試對象抗凝外周血5 mL，分離血清。排除標準：既往有高血壓、心臟病、肝炎、腎炎、自身免疫性疾病、內分泌疾病等合并癥；本次為多胎妊娠、妊娠有先兆流產、妊娠期高血壓疾病、糖尿病等產科并發癥及有臨床感染癥狀（包括孕婦體溫高于37.5℃、母體外周血白細胞≥15×109/L、胎心率＞l60次/min等）。

1.2 儀器設備和試劑

-70℃深低溫冰箱（日本SANYO公司）；實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；引物合成由上海Invitrogen公司完成；cDNA反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR工具包（日本Takara公司）；TrizolTMRNA隔離試劑（美國Invitrogen公司）。

1.3 實驗方法

sPLA2 mRNA的含量使用實時定量PCR法測定，具體步驟如下：（1）-80℃冰箱內取出凍存外周血，加入氯仿、異丙醇，沉淀并純化RNA，取RNA溶液2 μL，采用紫外分光光度計檢測樣本的光密度（optical density，OD）值和濃度，A260/A280均在1.8～2.0之間。（2）DNA消化酶Ⅰ處理RNA，去除基因組污染。配制反應液，37℃孵育60 min即得到無DNA的RNA溶液。逆轉錄反應，配制反應液，37℃反應15 min，4℃反應5 s，以此cDNA為模板進行實時定量PCR或長期保存于-70℃。（3）引物序列：GAPDH正義鏈5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，反義鏈5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′，引物長度18 bp。（4）配制實時PCR反應體系，在PCR儀上擴增，反應條件為94℃預變性5 min、94℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個循環。（5）△△Ct法分析結果：采用相對定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表達為內參基因，依據公式△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，分別計算實驗組和對照組的△Ct，再依公式△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，計算出△△Ct值，最后計算相對表達量的差值即2-△△Ct，它表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。

在實驗組患者結束妊娠后取胎膜行病理學檢查。組織學羊膜腔感染的診斷標準：采用HE染色法，絨毛膜板及羊膜上白細胞呈彌散性聚集，每個高倍鏡視野有5～10個中性粒細胞浸潤，且白細胞浸潤呈極性分布。確定有無組織學絨毛膜羊膜炎（histological chorioamnionitis，HCA）。

1.4 統計學分析

所有實驗數據用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析。實驗組和對照組間各計量資料的比較進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組與正常對照組外周血中sPLA2 mRNA的表達

實驗組在未分娩發動時與正常對照組患者入院時外周血中sPLA2 mRNA含量分別為1.079± 0.746和0.651±0.481。實驗組外周血中sPLA2 mRNA含量明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P=0.011）。

2.2 實驗組分娩發動時HCA患者與非HCA患者sPLA2mRNA的表達

入院時HCA患者與非HCA患者比較sPLA2 mRNA水平無統計學差異（P=0.480）。而分娩發動時，HCA患者sPLA2 mRNA水平高于非HCA患者（P=0.008），分娩發動時間HCA患者短于非HCA患者（P=0.020），差異均有統計學意義。見表1。

2.3 實驗組與足月對照組分娩發動時sPLA2 mRNA的表達

實驗組分娩發動時sPLA2 mRNA的含量（2.439±0.086）與足月對照組（2.575±0.036）比較無統計學差異（P=0.787），提示胎膜早破患者分娩發動時sPLA2表達隨著妊娠周數增加無明顯差異。

表1 HCA患者與非HCA患者間比較Tab.1 Comparison between HCA and non-HCA patients

3 討論

3.1 關于sPLA2在未足月胎膜早破發生中的作用

磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一種重要的調節和代謝酶類，廣泛存在于哺乳動物的細胞和體液之中，在體內發揮多種生理功能，如膜磷脂的降解和代謝、信號傳導、宿主防御、血液凝固、細胞膜重建、二十二烷酸前體生成等。

近年來，各醫學學科中sPLA2的作用主要集中在幾個方面：（1）腫瘤病變、細胞增殖、血管侵襲和腫瘤轉移等方面［7］；（2）與男性生殖相關，如精子獲能、頂體反應及受精過程中［8］；（3）與動脈粥樣硬化相關，有研究發現它們可以進而促進巨噬細胞和血管平滑肌細胞的泡沫化，促進膠原蛋白的暴露，從而導致動脈粥樣斑塊的形成和發展［9］。

PLA2可分為分泌型（sPLA2）、胞漿型（cPLA2）、非鈣離子依賴型（iPLA2）3種類型［4，5］。近年來有研究表明：sPLA2與cPLA2均被證實在人類妊娠組織中有表達，而且分娩發動時表達上調的是sPLA2［6］，妊娠期sPLA2主要表達在羊膜、絨毛膜、蛻膜或胎盤。

很多證據支持前列腺素在子宮收縮和啟動人類分娩機制方面起著重要作用，前列腺素合成大致分為3個階段，首先由磷脂酶催化膜磷脂生成花生四烯酸，接著由環氧合酶催化花生四烯酸生成前列腺素H2，最后各種特異性前列腺素合成酶催化生成前列腺素E、前列腺素F、前列環素和血栓素。可見前列腺素的合成中，sPLA2是一步極其重要的限速酶。這些結果提示早產或足月產時sPLA2表達上調可能是前列腺素合成增加的部分原因［2］。

本研究中我們發現，實驗組在未分娩發動時sPLA2水平即明顯高于正常對照組，而實驗組中HCA與非HCA患者入院時sPLA2水平無統計學差異，表明入院sPLA2高水平來自于胎膜早破，而不是宮內感染。在國內，有關sPLA2與早產關系的研究較少，現有研究表明早產臨產及足月臨產組血清磷脂酶A2含量均高于對照組。與研究發現的sPLA2在早產婦女的子宮下段肌層中表達顯著升高相符，所以作為重要分娩啟動機制的限速酶之一，sPLA2含量的測定可能對早產的預測非常有用［3］。

胎膜早破被認為是發動早產最可能的原因，隨著人們對未足月胎膜早破發病機制的不斷研究，現胎膜早破的發病機制研究已從單純的機械力學到感染、從細胞因子到基因水平，其中亞臨床宮內感染被認為是胎膜早破發病的主要原因，且與胎膜早破互為因果。胎膜早破多與感染及炎癥有關，感染時胎膜局部張力下降，炎癥時細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子α升高，可激活溶酶體酶，破壞羊膜組織導致胎膜早破［10］。

本研究表明，未足月胎膜早破患者外周血中sPLA2較同孕周正常妊娠患者升高（P＜0.05），提示胎膜早破的發生可能與sPLA2含量的增高有一定關系。sPLA2含量升高，使IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、腫瘤壞死因子α、γ干擾素等炎性因子分泌增加，引起一系列炎性反應，導致胎膜膠原加速降解，胎膜強度及韌性均有所下降，進而導致胎膜破裂。最近的國外研究表明：使用反義寡核苷酸抑制sPLA2的表達及酶活性可以抑制前列腺素合成［3］，這對降低早產的發生率提供了新的治療技術干預，對預防早產的發生提供了新方向。

3.2 未足月胎膜早破與羊膜腔內感染

早產是圍產醫學中的一個重要、復雜而又常見的妊娠并發癥。目前，早期嬰兒的死亡率中75%與早產有關，死于新生兒期者15%為早產兒，尚有8%的早產兒雖然存活，但可遺留下智力障礙或神經系統相關后遺癥［11］。其中未足月胎膜早破是造成極低及超低出生體質量兒的常見產科因素，并對新生兒圍產期總死亡率的升高貢獻達到了近20%［12］。所以，發生未足月胎膜早破后延長孕周，從而增加胎兒的成熟度，減少死亡率，同時避免宮內感染成為了產科醫生保守治療的目標，同時也是臨床工作中遇到的一大挑戰。一旦發現宮內感染，則應該盡快終止妊娠，減少新生兒感染等不良后果發生的可能性。但目前臨床上尚無一種令人滿意的實驗室檢查可以在早期發現或診斷宮內感染。目前臨床上常用的生物指標包括紅細胞沉降率、白細胞計數及C反應蛋白測定等。其中，臨床上最常用的是外周血白細胞計數及C反應蛋白水平。

白細胞計數升高是嚴重的全身性感染的臨床金標準，但其為非特異性，通常白細胞計數≥15× 109/L可早期輔助診斷HCA，但其在宮內感染早期診斷中的意義不大［13，14］。

C反應蛋白是一種隨著急性炎癥出現而升高的急性期反應蛋白。結合C反應蛋白隨時間的增長速度，可明顯增加其診斷細菌感染的精確性，所以作為一種標記物，C反應蛋白被廣泛用于感染、炎癥及惡性腫瘤的診斷。目前在產科臨床上，C反應蛋白經常被用作無明顯癥狀的宮內感染的診斷以及未足月胎膜早破后保胎過程中的宮內感染監測指標。當C反應蛋白≥2 mg/dL，或入院后每天濃度變異≥30%，則可協助HCA的診斷；C反應蛋白在臨界值，其百分變異系數＞15%（相隔6 h連續測定）應懷疑HCA感染。

由此可見，在實驗組分娩發動時與未伴隨HCA的實驗對象比較，伴隨HCA的實驗對象sPLA2表達升高，這提示了sPLA2的表達高低與HCA的發生具有一定關系。sPLA2的高表達可能在一定程度上啟動相關炎性反應的發生，進而從某一方面促成HCA的發生。另一方面，本實驗中sPLA2高表達者發動產程的時間明顯縮短（P=0.02），進一步說明sPLA2可能是加速分娩進程的重要因素之一。

3.3 sPLA2與妊娠周數的關系

本研究中，在實驗組及足月對照組分娩發動時，比較sPLA2的表達無明顯差異（P=0.787），這一結果的產生可能是因為本實驗入選實驗組及對照組的觀察例數較少，存在一定偏差。如擴大實驗的范圍或例數，也許能得出不一樣的結論。就本研究而言，胎膜早破分娩發動時sPLA2的表達高低與妊娠周數無明顯關系。

綜上所述，sPLA2的升高可能參與未足月胎膜早破的發病，同時其表達的高低從某種程度上促成了組織學HCA的發生。如對其深入研究，將有助于進一步闡明胎膜早破的發生機制，為預防胎膜早破、羊膜腔感染及早產提供新思路，為減少新生兒感染等不良后果的發生開辟新途徑。

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（編輯陳姜）

Correlation of Expression of Secretory Phospholipase A2 in Peripheral Blood and Infection of Amniotic Cavity in Preterm Premature Rupture of Membranes

ZHOU Yang，ZHOU Jia-ren，XU Man-fei，ZHANG Yi-shun，ZHAO Yan

（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To explore the role and significance of secretory phospholipase A2（sPLA2）in peripheral blood in preterm premature rupture of membranes（pPROM）and infection of amniotic cavity.MethodsRT-PCR was used to detect the expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood of 30 patients with pPROM（experimental group），30 non-full term normal pregnant patients without pPROM（normal control group）and 30 full term patients with PROM（full-term control group）before and after delivery.Fetal membranes were collected at the time of delivery of patients with pPROM for pathologic examination to determine histological chorioamnionitis（HCA）.ResultsThe expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood were 1.079±0.746 and 0.651±0.481 in the experimental group and the normal control group before delivery，respectively，indicating that the expression of sPLA2 mRNA was increased in the experimental group compared with the normal control group（P=0.011）.The expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood were 2.439±0.086 and 2.575±0.036 in the experimental group and the full-term control group at labor onset，respectively，indicating that there was no statistically significant difference in the level of sPLA2 mRNA in peripheral blood between the experimental group and the full-term control group at labor onset（P=0.787）.The level of sPLA2was related to chorioamnionitis in the experimental group at labor onset.ConclusionThe increase of sPLA2may participate in the pathogenesis of preterm premature rupture of membranes and is related with the infection of chorioamnionitis.

premature rupture of membranes；secretory phospholipase A2；chorioamnionitis；labor onset

R714.21

A

0258-4646（2015）06-0520-04

周洋（1988-），女，碩士研究生.

趙巖，E-mail：zhaoy@sj-hospital.org

2015-01-03

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