幽門螺桿菌感染性胃癌組織中Legumain、MMP-9的表達及其臨床意義

湯新躍

(廣東省第二人民醫院,廣東 廣州 510317)

幽門螺桿菌感染性胃癌組織中Legumain、MMP-9的表達及其臨床意義

湯新躍

(廣東省第二人民醫院,廣東 廣州 510317)

目的 探討幽門螺桿菌(H.pylori)感染性胃癌組織中半胱氨酸蛋白酶(Legumain)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達情況及其臨床意義。方法 選取手術切除胃癌組織標本109例，采用Warthin-Starry銀染色法檢測H.pylori感染情況，根據其H.pylori感染情況分為H.pylori陽性組59例和H.pylori陰性組50例，同時選取癌旁正常胃組織標本55例作為對照組，采用免疫組化方法檢測各組Legumain、MMP-9表達情況。結果 胃癌組織Legumain陽性率、MMP9陽性率均明顯高于對照組(P均<0.05)。H.pylori陽性組Legumain、MMP-9表達均與患者性別、組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移相關；其中男性、組織學分化程度越低、臨床分期越高及合并淋巴結轉移患者Legumain陽性表達率、MMP-9陽性表達率均明顯高于H.pylori陰性組(P均<0.05)；Legumain、MMP-9陽性表達率越高；經Pearson相關性分析發現：胃癌組織Legumain與MMP-9表達呈正相關(r=0.46，P<0.05)。結論 胃癌組織Legumain、MMP-9呈過度表達，其中H.pylori感染性胃癌組織Legumain、MMP-9陽性表達更顯著，且兩者表達與胃癌病情發生與發展密切相關，H.pylori感染可作為胃癌發生和發展的獨立危險因素之一。

胃癌；幽門螺菌感染；Legumain；MMP-9

幽門螺桿菌感染(H.pylori)在慢性胃炎、胃潰瘍、不典型增生、癌前病變和胃癌的發生和發展中發揮著重要的作用。半胱氨酸蛋白酶(Legumain)在結腸癌、乳腺癌等多數惡性腫瘤組織中呈過表達，Legumain的表達在癌癥患者的臨床預后中具有重要的意義，在惡性腫瘤發生和發展中發揮重要作用[1]。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)可促進腫瘤血管形成和細胞外基質降解，而二者在惡性腫瘤轉移浸潤中具有重要的臨床意義[2]。但關于MMP-9、Legumain在H.pylori感染性胃癌組織中的表達及其意義的研究較少。故本研究探討了Legumain、MMP-9在H.pylori感染性胃癌組織中的表達情況及其意義，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集我院2011年1月—2012年6月手術切除胃癌組織標本109例和距胃癌組織邊緣>5 cm的癌旁正常胃組織55例(對照組)，全部患者的臨床資料均來自院內病歷檔案記錄，術前未經放療、化療和免疫治療等輔助治療，術后經病理組織檢查符合胃癌的診斷標準[3]。109例胃癌患者男75例，女34例；年齡35～88(63.87±12.02)歲；組織高分化22例，中分化45例，低分化42例，TNM臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期36例，Ⅲ期42例，Ⅳ期19例；根據H.pylori感染情況(Warthin-Starry銀染色法測定)分為2組:H.pylori陽性組59例，男42例，女17例;年齡(64.07±13.01)歲；組織高分化12例，中分化25例，低分化22例；TNM臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期31例。H.pylori陰性組50例，男33例，女17例；年齡(62.99±12.87)歲；組織高分化10例，中分化20例，低分化20例；TNM臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期30例。對照組55例，男35例，女20例；年齡(61.54±10.34)歲；3組在性別、年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準和研究對象的知情同意。

1.2 方法 全部組織標本經4%甲醛固定，石蠟常規包埋，連續行4 μm厚度的組織切片，組織切片脫蠟脫水后給予pH6.0，0.01 mmol/L枸櫞酸鈉微波2 min，以達到抗原修復之目的。采用3%雙氧水常溫下孵育10 min，降低過氧化物酶活性，5%牛血清白蛋白常溫封閉1 h，滴加小鼠抗人Legumain單克隆抗體(1∶50,購自Santa Cruz公司)或兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶50,,購自Santa Cruz公司)，滴加PBS緩沖液作為陰性對照，低溫環境下孵育過夜，再滴加HRP(Horseradish Peroxidase)標記羊抗小鼠二抗(購自Santa Cruz公司)，室溫環境孵育1 h，DAB(3，3-diaminobenzidine)顯色劑(顯色劑盒購自北京康威生物公司)顯色，HE復染后脫水透明，樹膠封片。

1.3 陽性結果判定標準 Legumain、MMP-9陽性表達以細胞質內棕黃色顆粒為標準，隨機選取3個高倍鏡視野下細胞數目和陽性細胞數目，計算陽性細胞數/細胞數目的比值。比值≥50%為Legumain陽性，<50%為Legumain陰性；比值≥30%為MMP-9陽性，<30%為MMP-9陰性。

2 結 果

2.1 各組Legumain、MMP-9表達情況 H.pylori陽性組Legumain和MMP-9陽性表達率明顯高于H.pylori陰性組和對照組(P均<0.05)，H.pylori陰性組明顯高于對照組(P均<0.05)，見表1。Legumain、MMP-9在胃癌組織中免疫組化檢測表達情況見圖1和圖2。

表1 3組Legumain、MMP-9表達情況 例(%)

注：①與對照組比較，P<0.05;②與H.pylori陰性組比較，P<0.05。

圖1 胃癌組織Legumain表達的情況(×400)

圖2 胃癌組織MMP-9表達情況(×400)

2.2 Legumain、MMP-9的表達與臨床相關因素分析 胃癌組織Legumain陽性率為64.22%(70/109)，胃癌組織MMP-9陽性率為86.24%(94/109)。Legumain、MMP-9的表達與患者的性別、組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關，表現為男性、組織分化程度越低、臨床分期越高及合并淋巴結轉移者胃癌組織Legumain、MMP9陽性表達率越高，見表2。

2.3 胃癌組織Legumain與MMP-9表達的關系 胃癌組織Legumain與MMP-9表達呈正相關(r=0.46，P<0.05)，見表3。

3 討 論

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，其中我國胃癌發生呈明顯年輕化傾向。胃癌病死率高，臨床預后差，主要與胃癌的轉移、侵襲相關。進展期胃癌的生長較快，臨床發現的胃癌患者多處于中晚期，此類患者的遠期生存率極低。隨著對H.pylori的深入研究發現，H.pylori在不利于自身生長的胃液中引起細胞壁缺陷，增加對宿主細胞的黏附能力，避免對機體免疫攻擊，在人體內長期存在并導致胃黏膜的慢性損傷，甚至形成持續性炎癥性反應，增加胃部惡性腫瘤的發生[4]。Wang等[5]報道，H.pylori感染性胃癌的檢出率明顯高于H.pylori 感染性胃部良性病變，提示H.pylori在機體內長期生長可能與胃癌的發生和發展密切相關。于金林等[6]研究亦表明，H.pylori通過長期對胃黏膜細胞DNA破壞加重了胃癌的病情程度，且長期存在的H.pylori相關性感染加重了胃黏膜炎癥，使上皮細胞增生能力明顯增強，甚至出現不典型增生等癌前病變預兆[6]。因此，H.pylori在胃癌的發生和發展中具有重要意義。

表2 Legumain、MMP-9的表達與臨床病理因素關系

表3 胃癌組織Legumain與MMP-9表達的關系 例

MMP-9是MMP家族中分子質量較大的細胞基質金屬蛋白酶，活性MMP-9具有產生膠原酶的功能，可破壞腫瘤及其腫瘤附近的膠原蛋白，促進腫瘤細胞向缺乏基底膜的周圍組織轉移、浸潤，促進了腫瘤的進展[7-8]。同時其可促進腫瘤新生血管形成，加重腫瘤細胞的生長繁殖，加重疾病的病情程度[9]。Legumain是由腫瘤細胞及其巨噬細胞表達，在多數腫瘤中呈陽性表達，但在正常組織中呈低表達，提示Legumain在腫瘤的發生和發展中具有重要的臨床意義[10-11]。Legumain本質是蛋白酶，其中通過直接或間接作用于MMP-9，將MMP-9無活性蛋白酶形式逐漸向具有降低細胞外基質活性的MMP-9形式轉變，從而發揮增加腫瘤轉移程度的生物作用[12]。因此，在Legumain因子的靶向抗腫瘤細胞治療中，通過去除腫瘤細胞中的Legumain可有效降低腫瘤細胞生長繁殖及其侵襲轉移能力[18]。

本研究結果顯示，胃癌組織Legumain和MMP-9陽性率均明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，其中H.pylori陽性胃癌組織二者陽性表達率明顯高于H.pylori陰性胃癌組織，提示Legumain、MMP-9在H.pylori感染性胃癌組織中呈高表達，且明顯高于H.pylori陰性胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織。Legumain、MMP-9表達均與患者性別、組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移相關，表現為男性患者、組織分化程度越低、臨床分期越高及有淋巴結轉移的胃癌組織Legumain、MMP-9陽性表達率越高，提示胃癌越嚴重，兩者表達程度越高，與文獻[14-15]報道結果相一致；經進一步Pearson相關性分析還發現，胃癌組織Legumain與MMP-9表達呈正相關，證實兩者均可促進胃癌組織的生長，促進胃癌細胞的轉移和浸潤。因此，H.pylori感染性胃癌組織的Legumain、MMP-9的陽性表達率更高，在預測胃癌病情的嚴重程度中具有重要的意義。

綜上所述，胃癌組織Legumain、MMP-9呈過度表達，其中H.pylori感染性胃癌組織Legumain、MMP-9陽性表達更顯著，且兩者表達與胃癌病情發生與發展密切相關，H.pylroi感染可作為胃癌發生和發展的獨立危險因素之一。

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The express of Legumain, MMP9 in Helicobacter pylori infective gastric carcinoma tissue and its clinical significance

TANG Xinyue

(Guangdong NO.2 Provincial People’s Hospital, Guangzhou 510317, Guangdong, China)

Objective It is to observe the express of Legumain, MMP9 of Helicobacter pylori infective gastric cancer, and analyze the clinical significance. Methods 109 cases of gastric cancer tissue were collected to detect Helicobacter pylori (H.pylori) infection by Warthin-Starry silver staining method, and were divided into H.pylori positive group (n=59) and H.pylori positive group (n=50) according to H.pylori infection. 55 cases of normal gastric tissue were selected as control group at the same time. The expressions of Legumain, MMP9 were detected by immunohistochemistry for all cases. Results The positive expression rate of Legumain and MMP-9 in gastric cancer tissue were significantly higher than that of control group (allP<0.05), while the positive expression rate of Legumain and MMP-9 in H.pylori positive group were significantly higher than those in H.pylori negative group (allP<0.05). The expression of Legumain and MMP-9 were associated with gender, histological differentiation, clinical stage and lymph node metastasis, which of Male, histological differentiation degree of lower, clinical stage of higher and lymph node metastasis with higher positive expression rate of Legumain and MMP-9. Pearson correlation analysis showed that the Legumain express in gastric cancer was positively correlated with MMP-9 express in gastric cancer (r=0.46,P<0.05). Conclusion Legumain, MMP-9 are highly express in gastric cancer, and both positive express are higher in H.pylori infective gastric cancer, and are closely related to the occurrence and development of gastric cancer. H.pylori infection can be used as one of the independent risk factors for the occurrence and development of gastric cancer.

gastric cancer; helicobacter pylori; Legumain; MMP-9

湯新躍，男，主治醫師，主要從事臨床常見、多發腫瘤的綜合診治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.006

R735.2

A

1008-8849(2015)12-1270-04

2014-12-25