RKIP和VEGF在喉鱗癌及喉鱗狀上皮不典型增生組織中的表達及臨床意義

赫 莉，韓海平，馮志星，張慧平，要兆旭，連 蕾，楊 雪

(1. 河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001；2. 河北省人民醫院，河北 石家莊 050051)

論 著

RKIP和VEGF在喉鱗癌及喉鱗狀上皮不典型增生組織中的表達及臨床意義

赫 莉1，韓海平1，馮志星1，張慧平2，要兆旭1，連 蕾1，楊 雪1

(1. 河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001；2. 河北省人民醫院，河北 石家莊 050051)

目的通過檢測Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)、血管內皮生長因子 (VEGF)在喉鱗癌及喉鱗狀上皮不典型增生組織中的表達情況，分析二者在喉鱗癌發生、發展及轉移中的作用及可能分子機制。方法采用免疫組化方法檢測43例喉鱗癌組織、20例喉鱗狀上皮不典型增生組織及9例正常喉黏膜組織中RKIP、VEGF的表達情況，分析其臨床意義及二者之間的相關性。結果正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中RKIP表達陽性率逐漸降低，VEGF表達陽性率逐漸上升，喉鱗癌組織中RKIP表達陽性率顯著低于正常喉黏膜組織及喉鱗狀上皮不典型增生組織(P均<0.05)；有轉移的喉鱗癌組織中RKIP表達陽性率低于無轉移的喉鱗癌組織(P<0.05)，VEGF表達陽性率高于無轉移的喉鱗癌組織(P<0.05)。在正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中，RKIP與VEGF的表達呈顯著負相關(r=-0.324，P=0.006)。結論RKIP具有抑制喉鱗癌發展及轉移的作用，這可能是通過下調VEGF表達來實現的。

Raf-1激酶抑制蛋白；血管內皮生長因子；免疫組化；喉鱗狀細胞癌；喉鱗狀上皮不典型增生

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，組織學上以鱗狀細胞癌最多見。喉鱗癌的發生先從喉正常黏膜發展至鱗狀上皮不典型增生，最終轉變為喉鱗狀細胞癌。Raf-1激酶抑制蛋白(Raf -1 kinase inhibitor protein，RKIP )被認為是一種腫瘤轉移抑制基因，具有抑制腫瘤發生及轉移的功能，其表達水平在惡性腫瘤的發展及預后評估方面具有重要的指導作用[1]。血管內皮生長因子(vascular epidermal growth factor ,VEGF)是血管生成刺激因子，在腫瘤外侵、轉移中具有重要作用。本研究通過檢測正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織、喉鱗癌組織中RKIP、VEGF的表達情況，以探討二者在喉鱗癌發生、發展以及轉移中的作用及可能機制，為喉鱗癌的診斷治療提供新的方法。

1 臨床資料

1.1一般資料 所有標本取自白求恩國際和平醫院及邯鄲市中心醫院2007年1月—2014年2月收治患者，其中喉癌住院手術患者43例，男39例，女4例；年齡42～86歲，平均61歲；按國際抗癌協會(UICC)TNM分類標準(2002)修訂的方案屬于聲門上型17例，聲門型26例；T1期11例，T2期11例，T3期8例，T4期13例；臨床Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期8例，Ⅳ期15例；有淋巴結轉移10例，無淋巴結轉移33例；術后病理均證實為鱗狀細胞癌，均無遠處器官轉移。喉鱗狀上皮不典型增生手術患者20例，男18例，女2例；年齡46～64歲，平均52歲；不典型增生重度4例，中度9例，輕度7例。9例正常喉黏膜組織取自行全喉切除的喉癌患者，聲門型的喉癌在距原發灶邊緣0.5 cm以外的范圍采集，聲門上型的喉癌在距原發灶邊緣1.0cm 以外處采集，術后病理檢測均為分化良好且無腫瘤組織浸潤的鱗狀上皮。所有病例資料完整，術前未接受放射治療及化學治療。

1.2材料 山羊抗人RKIP多克隆抗體，為美國Santa Cruz公司產品。鼠抗人VEGF多克隆抗體，即用型二步法免疫組織化學試劑盒，光譜超敏SP法試劑盒和濃縮型DAB試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3實驗方法 所有標本經10%福爾馬林固定，4 μm連續切片，切片經DAB顯色、蘇木素復染、中性樹膠封片等步驟處理。所有病理切片由3名病理醫師在不知病例資料和腫瘤生物學特點的前提下閱片。對每張病理切片在高倍(×400)鏡下至少觀察10個不重復視野，判斷細胞著色率和著色強度。

1.4結果判定標準 染色細胞內有棕色顆粒為陽性表達。①RKIP表達參考文獻[2]采用半定量評分法判定：無陽性細胞為0分，陽性細胞<10%為1分，陽性細胞占10%～50%為2分，陽性細胞>50%～80%為3分，陽性細胞>80%為4分;染色強度按陰性、弱、中、強染色分別評為0～3分。最終評分按2個指標的乘積判定，0～3分為陰性(-)，4～8分為弱陽性(+)，9～12分為強陽性()。②VEGF表達參考文獻[2]采用半定量評分法判定：陽性細胞<25%為0分，陽性細胞占25%～50%為1分，陽性細胞>50%～75%為2分，陽性細胞>75%為3分; 染色強度按陰性、弱、中、強染色分別評為0～3分。最終評分按2個指標的乘積判定，0～3分為陰性(-)，4～8分為弱陽性(+)，9～12分為強陽性()。

1.5統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行統計處理。計數資料比較采用2檢驗，RKIP與VEGF的相關性比較采用Spearman秩相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同組織中RKIP和VEGF鏡下表達情況 RKIP、VEGF染色陽性表達均定位于細胞質，在正常喉黏膜的鱗狀上皮基底層中，RKIP多為陰性表達，在基底層以上的細胞層次中，RKIP多為陽性表達,見圖1。在喉鱗癌組織中分化較好的腫瘤細胞RKIP陽性表達較多，見圖2。VEGF的表達情況則與之相反，見圖3和圖4。

圖1 正常喉黏膜組織RKIP染色陽性表達情況(×400)

圖2 喉鱗癌組織RKIP染色陽性表達情況(×400)

圖3 正常喉黏膜組織VEGF染色陽性表達情況(×400)

圖4 喉鱗癌組織VEGF染色陽性表達情況(×400)

2.2不同組織中RKIP和VEGF陽性表達情況 喉鱗癌組織中RKIP表達陽性率顯著低于正常喉黏膜組織及喉鱗狀上皮不典型增生組織(P均<0.05)，喉鱗狀上皮不典型增生組織與正常喉黏膜組織相比差異無統計學意義(P>0.05)。正常喉黏膜組織、喉鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中VEGF表達陽性率有依次升高趨勢，但各組織間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 不同組織中RKIP和VEGF表達情況 例(%)

注：①與喉鱗癌組織比較，P<0.05。

2.3RKIP與VEGF在喉鱗癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 有淋巴結轉移者RKIP表達陽性率顯著低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，VEGF表達陽性率顯著高于無淋巴結轉移者(P<0.05)；不同年齡、腫瘤發病部位、T分期、臨床分期、腫瘤分化程度間二者表達陽性率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 RKIP與VEGF在喉鱗癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 例

注：①與無轉移比較，P<0.05。

2.4RKIP與VEGF的表達相關性分析 將RKIP與VEGF在正常喉黏膜組織、鱗狀上皮不典型增生組織及喉鱗癌組織中的表達情況做Spearman秩相關分析，結果二者呈顯著負相關性(r=-0.324，P=0.006)。見表3。

表3 RKIP與VEGF的表達相關性分析 例

3 討 論

晚期喉鱗癌無論手術或放療，療效均不佳，其發生發展機制尚未完全闡明。RKIP是磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)家族成員之一，是廣泛存在于人體組織中的一種高度保守的蛋白[3],它通過參與絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信號通路、核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路、G蛋白偶聯信號通路等多條信號通路發揮自身作用，影響細胞的生長、增殖及分化[4-6]。RKIP是一種腫瘤轉移抑制基因，其在腫瘤細胞中表達上調能夠促進腫瘤細胞分化，抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲能力；其表達下調能夠使腫瘤細胞穩定性下降，進而導致腫瘤細胞的侵襲力、轉移力增加，促進周圍侵襲及轉移發生。陳彥等[7]在RKIP低表達與鼻咽癌侵襲轉移和NF-κB信號通路活化相關的研究中發現，RKIP可能是鼻咽癌的一個轉移抑制蛋白，RKIP表達下調可能通過活化NF-κB信號通路促進鼻咽癌細胞侵襲和轉移。胡那日蘇等[8-9]研究發現RKIP表達的減少或缺失與腺樣囊性癌、口腔涎腺黏液表皮樣癌的發生發展、侵襲轉移密切相關。本研究結果發現，喉鱗癌組織中RKIP表達陽性率顯著低于正常喉黏膜組織及喉鱗狀上皮不典型增生組織，有淋巴結轉移者RKIP表達陽性率低于無淋巴結轉移者。提示RKIP與喉鱗癌的發生發展密切相關，RKIP表達陽性率低的喉鱗癌更易發生轉移，RKIP可抑制喉鱗癌發生轉移。本研究中喉鱗狀上皮不典型增生組織與正常喉黏膜組織相比差異無統計學意義，這可能是由于樣本量小或者免疫組化方法的敏感度尚不足以反映其差異，這一問題有待于進一步研究。

VEGF是血管生成刺激因子，它能夠與血管內皮細胞特異性相結合，促進血管內皮細胞增殖，增強血管通透性，是作用最強的血管生成因子之一[10]。許多實體腫瘤的生長過程中需要血管為其提供營養物質，所以VEGF在腫瘤的生長、侵襲及轉移中起著重要作用。本研究發現，有轉移的喉鱗癌組織中VEGF表達陽性率高于無轉移的喉鱗癌組織，故認為VEGF的表達上調可能是促進淋巴結轉移的分子機制之一。

綜上所述，在正常喉黏膜到喉鱗狀上皮不典型增生再到喉鱗癌的逐漸轉變過程中，RKIP表達是逐漸下降的，VEGF表達是逐漸上升的，RKIP與VEGF表達呈負相關性。由此推測，RKIP具有抑制喉鱗癌發展及轉移的作用，其可能的分子機制為RKIP通過某些途徑下調了VEGF的表達，從而實現抑制喉鱗癌發展及轉移的作用。

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Expressions and clinical significance of RKIP, VEGF in laryngeal squamous cell carcinoma, laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia

HE Li1, HAN Haiping1, FENG ZHI Xing1, ZHANG Huiping2, YAO Zhaoxu1, LIAN Lei1, YANG Xue1

(1.Handan Central Hospital, handan 056001, Hebei, China; 2.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to observe the expressions and clinical significance of Raf-1 kinase inhibitor protein (RKIP), vascular endothelial growth factor (VEGF) in laryngeal squamous cell carcinoma and laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia, and analyze the action of RKIP, VEGF in the occurrence and development of laryngeal squamous cell carcinoma as well as the possible molecular mechanisms. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of RKIP and VEGF in 43 cases of laryngeal squamous cell carcinoma tissue, 20 cases of laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia tissue and 9 cases of normal larynx squamous epithelium tissue. The clinical significance and correlation of them were analyzed. Results The expression of RKIP in normal larynx squamous epithelium tissues, laryngeal squamous cell carcinoma tissues and laryngeal squamous cell carcinoma tissues was decreased gradually, and the positive rate of VEGF expression was increased gradually. RKIP expression in laryngeal squamous cell carcinoma tissues was lower than that in normal larynx squamous epithelium tissues and laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia tissue (allP<0.05). RKIP expression in squamous cell carcinoma tissues with metastasis was significantly lower than that in squamous cell carcinoma tissues without metastasis (P<0.05), and VEGF expression was significantly higher than that in squamous cell carcinoma tissues without metastasis (P<0.05). In all cases, RKIP expression had negative correlation with VEGF expression (r=-0.324,P=0.006).Conclusion The RKIP may have the action of inhibition migration and metastasis in laryngeal squamous cell carcinoma by down-regulating VEGF expression.

Raf-1 kinase inhibitor protein; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry; laryngeal squamous cell carcinoma; laryngeal squamous epithelium atypical hyperplasia

赫莉，女，主治醫師，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科工作。

河北省衛生廳科研基金項目(20150462)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.27.001

R-33

A

1008-8849(2015)27-2965-04

2015-03-30