Netrin-1受體UNC5C廣泛甲基化與大腸癌的相關(guān)性分析

孫冬生，賈鳳杰，劉 寧，王 剛，李海洋，高春艷，王志鋼

(1.河北省唐山市開灤總醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

Netrin-1受體UNC5C廣泛甲基化與大腸癌的相關(guān)性分析

孫冬生1，賈鳳杰1，劉 寧1，王 剛1，李海洋1，高春艷1，王志鋼2

(1.河北省唐山市開灤總醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

目的探討神經(jīng)突起生長導(dǎo)向因子(Netrin-1)受體UNC5C廣泛甲基化與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。方法 使用結(jié)合重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法(COBRA)檢測(cè)54例散發(fā)性大腸癌組織及其相關(guān)正常黏膜組織以及52例大腸腺瘤組織中UNC5C啟動(dòng)子的2個(gè)區(qū)域(區(qū)域1和區(qū)域2)中UNC5C甲基化情況，分析UNC5C甲基化與大腸癌發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果廣泛UNC5C甲基化(區(qū)域1和區(qū)域2均甲基化)及部分甲基化(區(qū)域1或區(qū)域2甲基化)在大腸癌組織、腺瘤組織及正常黏膜組織中分別占59%(32/54)和87%(47/54)，8%(4/52)和38%(20/52)，0%(0/54)和9%(5/54)。無論廣泛還是部分UNC5C的甲基化率大腸癌組織均明顯高于腺瘤組織及正常組織(P均<0.05)。UNC5C基因在Ⅰ～Ⅱ期以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均顯著高于未甲基化水平，Ⅰ～Ⅱ期甲基化水平與Ⅲ～Ⅳ期甲基化水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。UNC5C甲基化與大腸癌發(fā)病呈顯著正相關(guān)(r=0.856，P<0.05)，但廣泛甲基化與腫瘤的分期并無明顯相關(guān)性。結(jié)論Netrin-1受體UNC5C甲基化及其范圍與大腸癌發(fā)生具有緊密聯(lián)系，值得臨床重視。

Netrin-1受體；UNC5C甲基化；廣泛甲基化；部分甲基化；大腸癌

大腸癌是一類高發(fā)性腫瘤，隨著社會(huì)的不斷發(fā)展和越來越多的化學(xué)試劑或物理射線等致癌因素的出現(xiàn)，其發(fā)病率也隨之呈上升趨勢(shì)[1]。大腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是由多個(gè)基因在一系列反應(yīng)過程中介導(dǎo)的組織細(xì)胞癌變。相關(guān)研究表明：神經(jīng)突起生長導(dǎo)向因子(Nertin-1)在大腸組織癌變中有關(guān)鍵促進(jìn)作用，而UNC5C作為Nertin-1的受體之一，亦與大腸癌變具顯著相關(guān)性[2]。另有研究報(bào)道，UNC5C屬一類抑癌性基因，其表達(dá)程度直接關(guān)系到大腸組織的癌變，而基因的表達(dá)受其啟動(dòng)因子甲基化的調(diào)控[3]。因此，本研究主要基于PCR擴(kuò)增技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法對(duì)UNC5C基因甲基化及其范圍與大腸癌的相關(guān)性進(jìn)行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2007年2月—2010年3月在開灤總醫(yī)院行大腸癌和腺瘤手術(shù)的病患中部分切除組織標(biāo)本，其中散發(fā)性大腸癌54例，男34例，女20例；年齡33～84(59.5±5.7)歲；結(jié)腸癌29例，直腸癌25例；TNM分期Ⅰ期12例；Dukes分期：A期6例；浸潤程度：T17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；Ⅱ期4例,Dukes分期：B期21例，浸潤程度：T23例，Ⅲ期13例，C期25例，T335例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。Ⅳ期25例；D期2例；T49例。大腸腺瘤52例，男37例，女15例；年齡32～83(64.8±3.8)歲。全部標(biāo)本均由病理學(xué)證實(shí)，病患在手術(shù)前無放、化療及其他生物治療等歷史。

1.2標(biāo)本采集 標(biāo)本源于病患大腸癌組織(避免在腫瘤中心處的壞死區(qū)采集)及手術(shù)的切緣組織(取自標(biāo)本的近切端相應(yīng)切緣處)及腺瘤組織。標(biāo)本在離體之后快速置于-196℃的液氮內(nèi)冷凍，之后置于-85℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩６罅砣〔糠纸M織放置在10%中性甲醛液內(nèi)固定并以石蠟包埋。

1.3主要儀器 德國Analytik Jena AG公司的flexcycler PCR儀，美國Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型電泳儀，美國Bio-Rad公司Sub-Cell GT電泳槽，加拿大carestream公司的Gel Logic 212PRO型凝膠成像的分析系統(tǒng)；美國Thermo公司Ultro freeze 3410超低溫冰箱，中國寧波永新光學(xué)股份有限公司NIB-100型顯微鏡等。

1.4主要試劑 PCR擴(kuò)增引物中各序列均由上海英駿公司設(shè)計(jì)合成；瓊脂糖購于美國Promega公司；寶生物TEXPAT試劑盒；EZ DNA Methylation KitTM。

1.5研究方法石蠟標(biāo)本DNA抽出使用寶生物TEXPAT試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行仔細(xì)操作。使用EZ DNA Methylation KitTM進(jìn)行DNA的亞硫酸鹽處理。經(jīng)甲基化引物增擴(kuò)后使用結(jié)合重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法(COBRA法)進(jìn)行分析。

1.6甲基化引物 UNC5C 區(qū)域1：上游引物為GTYGGTT GGGGTAGTGTAAAAGTT，下游引物為AACCTACCRCCTAC CACCTTCTTC；區(qū)域2：上游引物為TTTAGTGGGGTTTTTAGT TGTTTG，下游引物為TATCCCAATCCCAATCCRCAAC。56℃ 5次，54℃ 10次，52℃ 30次，產(chǎn)物長度分別為175bp和125bp；酶切后產(chǎn)物長度分別為(Hhal 37℃，12h)175bp、146bp和125bp、100bp(Hhal)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)資料采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組組織標(biāo)本中UNC5C廣泛甲基化與部分甲基化情況比較 大腸癌組織組UNC5C廣泛甲基化率為59%(32/54)，腺瘤組織為8%(4/52)，正常黏膜組織為0，大腸癌組織UNC5C廣泛甲基化率顯著高于腺瘤組織及正常黏膜組織(P均<0.05)；大腸癌組織中UNC5C部分甲基化率為87%(47/54)，腺瘤組織為38%(20/52)，正常黏膜組織為9%(5/54)，大腸癌組織中UNC5C部分甲基化率亦顯著高于腺瘤組織及正常黏膜組織(P均<0.05)。

2.2UNC5C甲基化與腫瘤TNM分期情況比較 大腸癌組織中，Ⅰ+Ⅱ期患者UNC5C甲基化(包括廣泛甲基化和部分甲基化)率為81%(13/16)，非甲基化率為19%(3/16)，甲基化率顯著高于非甲基化率(t=0.543,P<0.05)；Ⅲ+Ⅳ期患者UNC5C甲基化率為82%(31/38)，非甲基化率為18%(7/38)，甲基化率顯著高于非甲基化率(t=0.842,P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ期與Ⅲ+Ⅳ期患者的甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3病理參數(shù)與UNC5C甲基化相關(guān)性分析 大腸組織癌變與UNC5C廣泛甲基化和部分甲基化均具顯著相關(guān)性(P均<0.05)，Dukes分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、TNM分期與UNC5甲基化、廣泛甲基化及部分甲基化均無明顯相關(guān)性，尤其與UNC5C廣泛甲基化無明顯相關(guān)性。見表1。

表1 大腸癌病理參數(shù)與UNC5C甲基化Spearman相關(guān)性分析

3 討 論

Nertin-1主要通過激活受體或信號(hào)通道介導(dǎo)大腸組織癌變[5-6]。UNC5H基因作為 Nertin-1的受體之一，其足夠的表達(dá)水平能夠?qū)Υ竽c癌變產(chǎn)生抑制作用。UNC5C為UNC5H基因家族中的一種，與大腸惡性腫瘤的產(chǎn)生具有顯著相關(guān)性[7]。Thiebault等[8]在對(duì)多種腫瘤的UNC5A～C表達(dá)水平研究中發(fā)現(xiàn)，各種腫瘤中UNC5A～C的表達(dá)水平均顯著低于相應(yīng)對(duì)照組(P均<0.05)。劉旭東[9]研究發(fā)現(xiàn)80%的大腸癌患者癌組織中UNC5C表達(dá)水平低于其切除邊緣組織，得出UNC5C基因的表達(dá)水平對(duì)大腸癌疾病發(fā)展程度以及治療效果的診斷具有積極意義。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UNC5C廣泛甲基化率、部分甲基化率癌變組織中均顯著高于腺癌組織及正常黏膜組織，表明無論是UNC5C廣泛甲基化還是部分甲基化均與癌變組織呈顯著正相關(guān)性。在UNC5C甲基化與腫瘤TNM分期的比較中，Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期甲基化水平均顯著高于非甲基化水平，而Ⅰ+Ⅱ期甲基化率與Ⅲ+Ⅳ期甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明UNC5C甲基化率與TNM分期無顯著相關(guān)性。而Spearman相關(guān)性分析顯示癌變組織與UNC5C甲基化、廣泛甲基化、部分甲基化均具顯著相關(guān)性，而癌變Dukes分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、TNM分期與UNC5C甲基化、廣泛甲基化及部分甲基化均無顯著相關(guān)性，尤其與UNC5C廣泛甲基化無明顯關(guān)聯(lián)。

綜上所述，UNC5C廣泛甲基化及部分甲基化均與大腸癌變具顯著相關(guān)性，提示Netrin-1受體UNC5C甲基化及其范圍與大腸癌發(fā)病具有緊密聯(lián)系，值得臨床重視。

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Correlation analysis of Netrin-1receptor UNC5C wide methylation and colorectal cancer

SUN Dongsheng1, JIA Fengjie1, LIU Ning1, WANG Gang1, LI Haiyang1, GAO Chunyan1, WANG Zhigang2

(1.Kailuan General Hospital, Tangshan 063000, Hebei, China; 2.Life Sciences College of Inner Mongolia University, Hohhot 010021, Inner Mongolia, China)

Objective It is to approach the correlation of Netrin-1receptor UNC5C wide methylation and colorectal cancer in occurrence, development of colorectal cancer.Methods Methylation state of UNC5C in two regions of the promoter of UNC5C (zones 1and 2) in 54patients with sporadic colorectal cancer related normal mucosa, and 52cases of colorectal adenoma tissue by using combined bisulfite restriction endonuclease method (COBRA), than the correlation of UNC5C methylation and incidence of colorectal cancer.Results The rate of extensive methylation of UNC5C (region 1and region 2methylation) and partial methylation (zone 1or zone 2methylated) in Colorectal cancer, adenoma and normal mucosa tissues is 59% (32/54) and 87% (47/54), 8% (4/52) and 38% (20/52), 0% (0/54) and 9% (5/54) respectively.Whether widely or part methylation rate of UNC5C in colorectal cancer was significantly higher in adenoma and normal mucosa tissues (allP<0.05).The methylation levels of UNC5C gene in Ⅰ to Ⅱ stage and Ⅲ to Ⅳ stage were significantly higher than those of no methylation, there was no significant difference in methylation level between Ⅰ to Ⅱ stage and Ⅲ to Ⅳ stage (P>0.05).UNC5C methylation was positively correlated with the incidence of colorectal cance (r=0.856,P<0.05), but there was no correlation between extensive methylation and tumor stage.Conclusion Netrin-1receptor UNC5C methylation and its range is close contacted to the colorectal diseases, it is worthy of attention.

Netrin-1receptor; UNC5C methylation; extensive methylation; partial methylation; colorectal cancer disease

孫冬生，男，主治醫(yī)師，從事抑癌基因甲基化與消化道腫瘤關(guān)系的研究。

中國煤炭工業(yè)協(xié)會(huì)2012年度科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目(MTKJ2012-420)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.18.009

R0735.34

A

1008-8849(2015)18-1964-03

2015-03-02