原發性膽汁性肝硬化臨床特點及其與人巨細胞病毒感染的相關性

趙素賢，張玉果，李文聰，王榮琦，南月敏*，趙景民

(1.河北醫科大學第三醫院中西醫結合肝病科，河北 石家莊 050051；2.中國人民解放軍第三零二醫院病理診斷中心，北京 100039)

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·論 著·

原發性膽汁性肝硬化臨床特點及其與人巨細胞病毒感染的相關性

趙素賢1，張玉果1，李文聰1，王榮琦1，南月敏1*，趙景民2

(1.河北醫科大學第三醫院中西醫結合肝病科，河北 石家莊 050051；2.中國人民解放軍第三零二醫院病理診斷中心，北京 100039)

目的探討原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)臨床、血清學特點及其與人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)之間的相關性。方法收集PBC患者45例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者60例和健康獻血者(正常對照組)70例，比較3組血清檢測指標和HCMV DNA。結果PBC組和CHB組丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、總膽紅素(serum total bilirubin，TBil)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、IgM高于正常對照組，白蛋白(albumin，Alb)低于正常對照組，PBC組γ-谷氨酰轉移酶(glutamyl transpeptidase，γ-GT)高于正常對照組(P<0.05)；PBC組AST、TBil、DBil、ALP、γ-GT、TC、TG、IgM 高于CHB組(P<0.05)。3組抗HAV-IgM、抗-HCV、抗-HDV、抗HEV-IgM及抗HEV-IgG、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗肝腎微粒體抗體(anti-liver-kidney microsomal antibody，LKM)均為陰性，IgG、IgA均在正常范圍內。3組HCMV DNA陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論PBC患者臨床表現以膽汁淤積性改變為主，對于抗線粒體抗體陰性的患者需通過病理學確診，肝病患者易感染HCMV。

肝硬化，膽汁性；乙型肝炎,慢性；巨細胞病毒

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種原因不明的慢性炎癥性和膽汁淤積性肝臟疾病。它以血清中存在針對線粒體內膜抗原的自身抗體即抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibodies，AMA)、肝臟內進行性小膽管損壞伴門管區炎癥、慢性膽汁淤積和肝纖維化為特點，并可最終進展至肝硬化和肝衰竭，肝移植是惟一的有效治療方法。該病主要發生在中年女性，常并發各種肝外器官特異性自身免疫性疾病如自身免疫性甲狀腺疾病、干燥綜合征、類風濕性關節炎等[1]。其確切的發病機制和病因不太清楚，目前有研究表明與分子模擬機制有關的感染因素在發病機制中的地位很重要，通過在Genbank中序列對比后發現人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)序列與AMA有高度同源性，提示HCMV可能在PBC的發病過程中起重要作用。本研究對45例資料完整行肝穿刺的PBC患者的臨床及血清學特點進行分析，檢測PBC患者血清中HCMV DNA，旨在探討HCMV感染與PBC之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫科大學第三醫院及中國人民解放軍第三零二醫院經病理確診的臨床資料完整的PBC患者45例，男性5例，女性40例，年齡11～75歲，平均(43.5±6.1)歲。PBC的診斷標準[2]: ①堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等指標升高；②上腹部B超、內鏡逆行性胰膽管造影術和磁共振胰膽管造影檢查示膽管正常；③AMA和(或)AMA-M2亞型陽性；④如果血清AMA/AMA-M2陰性，病理檢查符合PBC的改變，除外肥胖、酒精、病毒、藥物等因素所引起的肝損者。另選擇同期慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者60例作為CHB組、健康獻血者70例作為正常對照組。CHB組男性8 例，女性52例，年齡23～76歲，平均(43.2±6.3)歲；正常對照組男性11例，女性59例，年齡20～56歲，平均(44.3±7.0)歲。3組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 肝臟生化及免疫學指標檢測 應用奧林巴斯AU5400 全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、ALP、γ-谷氨酰轉移酶(glutamyl transpeptidase，γ-GT)、總膽紅素(serum total bilirubin，TBil)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBil)、白蛋白(albumin，Alb)、球蛋白(globulin，Glob)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)等。采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測抗甲型肝炎病毒IgM抗體(anti-hepatitis A virus IgM antibody,抗HAV IgM)、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、抗乙型肝炎病毒表面抗體(anti-hepatitis B virus surface antibody,抗-HBs)、抗乙型肝炎病毒核心抗體(anti-hepatitis B core antigen,抗-HBc)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)、抗乙型肝炎病毒e抗體(anti-hepatitis B e antigen,抗-HBe)、抗丙型肝炎病毒抗體(anti-hepatitis C virus antibody，抗-HCV)、丁型肝炎抗體(anti-hepatitis D virus antibody，抗-HDV)、抗戊型肝炎病毒IgM抗體(anti-hepatitis E virus IgM antibody,抗HEV-IgM)及抗戊型肝炎病毒IgG抗體(anti-hepatitis E virus IgG antibody,抗HEV-IgG)。采用免疫熒光法檢測抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗肝腎微粒體抗體(anti-liver-kidney microsomal antibody，LKM)、AMA及分型、免疫球蛋白(IgG，IgA，IgM)。

1.3 血清HCMV DNA提取 小量基因組DNA極速抽提試劑盒DNA fast 2000(上海飛捷生物技術有限公司)，HCMV PCR 引物由北京賽百盛公司合成。引物設計根據HCMV(AD169株)早期基因外顯子設計。外引物：5′端引物為5′-ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG-3′；3′端引物為5′-CAATACACTTCATCT CCTCG-3′；擴增片段為721 bp。內引物：5′端引物為5′-GTGACCAAGG-CCACG ACGTT-3′；3′端引物為5′-TCTGCCAGG-ACATCTTTCTC-3′；擴增片段為167 bp。

1.4 套式PCR檢測 HCMV DNA 50μL反應體系，10×dNTP 5 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，Buffer 5 μL，上下游引物各1 μL，水補足50 μL。第1次PCR反應為2 μL模板DNA加入50 μL HCMV反應體系(含外引物)，94 ℃ 3 min,94 ℃ 40 s,52 ℃ 150 s，72 ℃ 40 s，擴增 35個循環后，72 ℃延伸 8 min；2 μL PCR產物加入第2次PCR反應體系(含內引物)中，94 ℃ 3 min,94 ℃ 40 s，52 ℃ 150 s，72 ℃ 40 s，擴增 35個循環后，72 ℃延伸3 min。擴增產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察以出現167 bp擴增片段為陽性，設立陰性對照，HCMV DNA陽性對照由中國疾病控制中心病毒研究所提供。

2 結 果

2.1 PBC的臨床表現 PBC起病隱匿，中年女性多見，共同特征是黃疸、瘙癢癥狀明顯，肝炎病毒標記物陰性。45例PBC患者中臨床表現為乏力39例(86.7%)、黃疸35例(77.8%)、瘙癢30例(66.7%)、脾大25例(55.6%)。并發自身免疫性疾病4例，其中潰瘍性結腸炎1例、橋本甲狀腺炎2例、干燥綜合征1例。

2.2 血清學檢測 PBC組和CHB組ALT、AST、TBil、DBil、ALP、TC、TG、IgM高于正常對照組，Alb低于正常對照組，PBC組γ-GT高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，CHB組γ-GT與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；PBC組AST、TBil、DBil、ALP、γ-GT、TC、TG、IgM 高于CHB組，差異有統計學意義(P<0.05)，ALT和Alb與CHB組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

PBC組AMA陽性32例(71.1%)，CHB組、正常對照組AMA均為陰性。3組抗HAV-IgM、抗-HCV、抗-HDV、抗HEV-IgM及抗HEV-IgG、ANA、LKM均為陰性，IgG、IgA均在正常范圍內。

表1 PBC組、CHB組及正常對照組血清學檢測比較

組別例數ALT(U/L)AST(U/L)TBil(μmol/L)DBil(μmol/L)ALP(U/L)PBC組45103.0±30.1*93.2±32.4*#46.7±5.5*#29.1±6.3*#419.0±140.5*#CHB組60108.4±34.2*111.7±23.1*42.1±18.2*22.3±8.1*70.0±21.2*正常對照組7021.0±3.117.0±2.610.7±1.13.2±0.752.0±4.6 F239.316357.73194.168327.850413.564 P0.0000.0000.0000.0000.000組別例數γ-GT(U/L)Alb(g/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)IgM(g/L)PBC組45475.5±170.3*#38.1±4.3*6.9±3.2*#1.8±0.7*#5.8±2.7*#CHB組6047.0±8.439.2±5.8*5.3±1.6*1.0±0.9*2.7±0.6*正常對照組7027.0±5.347.5±4.33.9±1.20.7±0.21.9±0.3 F433.46568.86830.49340.32878.695 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05與正常對照組比較 #P<0.05與CHB組比較(q檢驗)

2.3HCMVDNA檢測 3組HCMVDNA陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 3組HCMV DNA陽性率比較

圖1 3組CMVDNA檢測結果

Figure1ResultsofCMVDNAdetectioninthreegroups

3 討 論

本研究PBC患者均經病理確診，其特點為好發于中年女性，以γ-GT、ALP升高等膽汁淤積性變化為主，并且IgM升高，符合2009年美國肝病學會制定的PBC診斷標準。與國外報道一致[3]。考慮雌激素誘導的膽汁淤積可能與PBC有關。研究表明雌激素在PBC發生發展及臨床表現中起重要作用，在淋巴細胞成熟、激活、合成抗體及細胞因子扮演重要角色[4]，膽管上皮細胞表達雌激素受體，因此妊娠可出現PBC所致的膽汁淤積，同時外源性激素在PBC發病中起了一部分作用[5]。關于性別與臨床表現報道少見，英國的研究表明男性、女性患者壽命基本相同，男性患者瘙癢癥狀出現少，但肝癌發生率高[6]。研究結果表明男性很少并發自身免疫性疾病，預后好，同樣肝癌發生率高[7]。以上均提示男性PBC患者應注意監測腫瘤的發生。本研究結果顯示PBC并發潰瘍性結腸炎、橋本甲狀腺炎、干燥綜合癥，與文獻報道一致[8]，因此診治過程中需注意鑒別是否并發其他自身免疫性疾病。

PBC患者血清中存在針對線粒體內膜抗原的自身抗體即AMA，是PBC的血清學標記物。本研究中AMA陽性率為71.1%，低于其他學者報道的95%[9]。其原因可能是部分病例為AMA陰性，由肝穿刺病理確診。提示懷疑為PBC的AMA陰性患者，有必要通過病理確診。此外，可能與檢測方法的靈敏度有關[10]，應用敏感的MIT3ELISA試劑盒檢測，90%AMA陰性患者可檢測出AMA。有報道AMA陰性患者ALP水平低，很少出現瘙癢，但易并發自身免疫性疾病[10]。文獻報道AMA陰性與AMA陽性患者在性別、年齡、乏力、黃疸和皮膚瘙癢癥狀的發生率及其他各項檢查結果方面差異無統計學意義[11]。最近的研究顯示AMA陽性患者可溶性CTLA-4水平明顯高于陰性患者，表明二者的免疫狀態不同[12]。

本研究表明乏力、瘙癢是PBC患者的主要癥狀，因此PBC患者生活質量差[13]。一項9年的縱向研究顯示，研究初期出現乏力者生存期較未出現者短，只有肝移植可改善患者乏力癥狀，但很大一部分患者移植術后2年會再次瘙癢[14]。瘙癢的機制目前尚不明確，考慮與組胺、5-羥色胺、胃腸激素等有關[15]。此外，膽汁淤積性瘙癢可能與溶血磷脂酸有關[16]，小鼠皮下注射溶血磷脂酸可出現搔抓反應，這為膽汁淤積相關性瘙癢治療提供了新的方向；本研究結果顯示PBC患者γ-GT、ALP、TBil、DBil和IgM顯著升高，與文獻報道一致[10]，TC、TG平均值高于正常水平可能與脂質代謝障礙有關。

目前PBC的發病機制尚不清楚，有研究認為可能與感染因素有關，病原體可能通過分子模擬導致機體免疫耐受喪失，從而參與PBC的發病[17]。分子模擬是指機體受到病原微生物感染或接觸化學物品時，由于病原微生物的某些抗原表位與人體自身組織蛋白的抗原表位相同或相似，導致機體對自身抗原免疫耐受喪失，刺激機體產生激活的淋巴細胞或抗體與組織抗原發生交叉反應，導致組織器官的損傷，病毒被認為是很多自身免疫性疾病的可能性病因，如風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等。在PBC中尚未見報道明確的病毒感染與其發病相關。由于PBC患者的特征性抗體AMA抗體與CMV的序列有高度同源性，因此本研究檢測了PBC患者血清中HCMV的陽性率，血清HCMVDNA是活動性感染的標志，HCMVDNA陽性血清中存在游離的HCMV。PCR法是目前敏感度高的基因檢測手段之一，用套式PCR檢測血清和白細胞的HCMVDNA，能較好地反映機體HCMV帶病毒狀態。本研究結果顯示，PBC組、CHB組HCMVDNA陽性率均高于健康對照組，PBC組與CHB組的陽性檢出率差異無統計學意義。提示肝病患者易患HCMV感染，在治療過程中應給予重視。

總之，PBC是一種原因不明的慢性自身免疫性肝臟疾病。臨床癥狀無特征性，可表現為現乏力、黃疸、瘙癢，可并發自身免疫性疾病；實驗室檢查可表現為γ-GT、ALP、TBil和IgM顯著升高，AMA陽性。隨著臨床醫師對該病的臨床及病理學認識加深，其早期診斷明顯提高。雖然熊去氧膽酸是治療PBC的安全有效藥物，但尚有治療不佳的患者。因此，仍需進一步研究其發病原因，為臨床的有效治療提供依據。

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(本文編輯：趙麗潔)

Characteristics of primary biliary cirrhosis and its relationship with human cytomegalovirus

ZHAO Su-xian1,ZHANG Yu-guo1,LI Wen-cong1,WANG Rong-qi1,NAN Yue-min1*,ZHAO Jing-min2

(1.Department of Traditional and Western Medical Hepatology,the Third Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050051,China；2.Department of Pathology,the 302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China)

Objective To explore the clinical features of primary biliary cirrhosis(PBC) and the association between PBC and human cytomegalovirus(HCMV).Methods The nested polymerase chain reaction was used to detect serum HCMV DNA from 45 PBC patients,60 chronic hepatitis B(CHB) patients and 70 healthy blood donors.The data of three groups were analyzed.Results ALT,AST,TBil,DBil,ALP,TC,TG,IgM,Alb in PBC group and CHB group were significantly higher than those in normal control group,while Alb was lower than that in normal control group(P<0.05).γ-GT in PBC group was higher than that in normal group(P<0.05).AST,TBil,DBil,ALP,γ-GT,TC,TG and IgM in PBC group were higher than those of CHB group(allP<0.05).All anti-HAV-IgM,anti -HCV,anti-HDV,anti-HEV-IgM,anti HEV-IgG,ANA and anti-LKM in three groups were negative,but IgG and IgA were all in normal range.The seroprevalence of HCMV DNA among three groups showed statistic significance(P<0.05),but there was no significant difference between PBC group and healthy group(P>0.05).Conclusion Cholestasis was the main clinical feature of PBC.The pathological diagnosis was necessary for anti-mitochondrial antibodies negative patients.The results suggested that patients with liver diseases were susceptible to HCMV.

liver cirrhosis,biliary；hepatitis B,chronic；cytomegalovirus

2015-04-01；

2015-06-01

河北省醫學科學研究重點課題(20130219)；河北省中醫藥類科研計劃課題(2013016；2014143)；中國肝炎防治基金天晴肝病研究基金項目(TQGB20140203)

趙素賢(1976-)，女，河北高邑人，河北醫科大學第三醫院主治醫師，醫學博士研究生，從事肝臟疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：nanyuemin@163.com

R575.22

A

1007-3205(2015)11-1259-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.006