T-SPOT.TB與結核蛋白芯片檢測在結核性腦膜炎輔助診斷中的對比分析

呂翠環，鄭立恒，王 紅，張聰瑤，李玉靜，朱桂云

(1.河北省胸科醫院檢驗科,河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫院病理科,河北 石家莊 050041)

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·論 著·

T-SPOT.TB與結核蛋白芯片檢測在結核性腦膜炎輔助診斷中的對比分析

呂翠環1，鄭立恒1，王 紅1，張聰瑤1，李玉靜1，朱桂云2

(1.河北省胸科醫院檢驗科,河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫院病理科,河北 石家莊 050041)

目的探討結核感染T細胞酶聯免疫斑點試驗(Tcellsspottestoftuberculosisinfection,T-SPOT.TB)與結核蛋白芯片檢測在結核性腦膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)中的輔助診斷價值。方法采集TBM患者血標本分別進行T-SPOT.TB與結核蛋白芯片檢測,并對2種方法進行評價分析。結果T-SPOT.TB檢測TBM的敏感度和準確度分別為71.88%、77.97%，高于結核蛋白芯片檢測的48.78%、60.29%(P<0.05或<0.01)，T-SPOT.TB和結核蛋白芯片檢測TBM的特異度差異無統計學意義(85.19% vs 77.78%，P>0.05)。結論在輔助診斷TBM方面T-SPOT.TB檢測方法優于結核蛋白芯片檢測。

結核,腦膜；酶聯免疫斑點測定；結核蛋白芯片檢測doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.030

結核性腦膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)是較常見的肺外結核病之一，其臨床表現復雜、多樣，病情進展迅速，診斷和鑒別診斷較為困難，易造成誤診而帶來嚴重后果[1]。因此，尋找一種無創、快速和準確的診斷方法是提高TBM診斷水平的關鍵。當前較常用的快速診斷結核性腦膜炎的方法中涂片鏡檢和聚合酶鏈反應敏感度較差,且腦脊液標本不易獲取。本研究以TBM患者的血液標本進行結核感染T細胞酶聯免疫斑點試驗(Tcellsspottestoftuberculosisinfection,T-SPOT.TB)檢測γ干擾素釋放水平，并與結核蛋白芯片法檢測比較，探討二者對TBM的診斷價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年5月—2014年10月在河北省胸科醫院臨床確診的TBM患者73例，均符合TBM診斷標準[2]。隨機分為：T-SPOT.TB組32例，男性18例，女性14例，年齡11～74歲,平均(38.6±18.1)歲；結核蛋白芯片檢測組41例，男性23例，女性18例，年齡11～77歲，平均(38.1±16.2)歲。所有患者均出現不同程度的發熱、頭痛、嘔吐癥狀，腦膜刺激征陽性。另選取非TBM患者27例作為特異度檢測的對照組，男性15例,女性12例，年齡7～78歲，平均(39.5±16.4)歲，其中病毒性腦炎18例,化膿性腦膜炎9例。

1.2 試劑與儀器T-SPOT.TB試劑盒來自英國OxfordImmunotech公司，結核蛋白芯片試劑盒及PBT-X2型生物識別判讀儀均來自南京大淵生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1T-SPOT.TB檢測 ①外周血單個核細胞的分離、收集與計數；②體外抗原刺激與孵育；③結果判定：陰性對照孔斑點數為0～5個，抗原A或抗原B檢測孔計數-陰性孔計數≥6判為陽性；如果陰性對照孔斑點數≥6，檢測孔斑點數≥2倍陰性孔斑點數判為陽性。操作過程嚴格按照說明書進行。

1.3.2 結核蛋白芯片檢測 由南京大淵生物技術公司應用該公司生產的結核抗體蛋白檢測系統對血清標本進行檢測，根據系統芯片閱讀儀設置參數自動判別檢測結果。采用本芯片檢測結核分枝桿菌共有3個指標，分別是脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomanan,LAM)、相對分子質量16 000蛋白和38 000蛋白，其中任何1個指標陽性均計為結核分枝桿菌抗體陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件分析數據，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

TBM組和對照組患者均進行T-SPOT.TB和結核蛋白芯片檢測。若以TBM組T-SPOT.TB和結核蛋白芯片陽性結果判為真陽性(a)、陰性結果判為假陰性(c)，對照組T-SPOT.TB和結核蛋白芯片陽性結果判為假陽性(b)、陰性結果判為真陰性(d)，按照敏感度=a/(a+c)×100%，特異度=d/(b+d)×100%，準確度=(a+d)/(a+b+c+d)×100%，計算出敏感度、特異度、準確度。

2種檢測方法中敏感度比較差異有統計學意義(χ2=3.960,P=0.047)，特異度比較差異無統計學意義(χ2=0.491,P=0.480)，準確度比較差異有統計學意義(χ2=4.573,P=0.003)，見表1。

表1 2種檢測方法的敏感度、特異度和準確度 (例數)

3 討 論

隨著相關結核感染性疾病診斷技術的不斷問世，T-SPOT.TB檢測成為診斷肺外結核病的重要手段，尤其是對TBM[3],T-SPOT.TB已成為目前敏感度較高的細胞學檢測技術[4]。結核蛋白芯片反應是一種體液免疫，是由體內B細胞產生的免疫球蛋白,運用蛋白芯片技術聯合檢測LAM、相對分子質量38 000蛋白與16 000蛋白也可提高靈敏度[5]，本研究就2種檢測方法的敏感度、特異度、準確度進行分析對比。

T-SPOT.TB原理是機體受到結核分枝桿菌感染后產生的記憶性T細胞，在再次受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激時會釋放γ干擾素，可以在體外對釋放的γ干擾素水平或能有效釋放γ干擾素的T細胞進行定量檢測，從而判斷患者是否為結核分枝桿菌的感染者。結核桿菌蛋白芯片檢測原理是以微孔濾膜為載體,利用微數組技術將純化的結核分枝桿菌LAM、基因工程生產并純化的結核分枝桿菌16 000蛋白和38 000蛋白3種抗原固定在同一膜片上,并利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用,使抗原抗體反應在微孔濾膜上快速進行,以免疫金為標記物在膜上直接顯色,通過芯片識別儀,在專門軟件的支持下對不同抗原點陣的灰度值進行分析，實現3種抗原對抗體同步檢測,其中任何1個指標陽性均提示結核分枝桿菌抗體陽性，從而快速對結核菌感染情況作出診斷。

本研究以化膿性腦膜炎和病毒性腦炎為對照組，對TBM患者血標本分別進行T-SPOT.TB及結核蛋白芯片檢測，T-SPOT.TB檢測的敏感度和準確度高于結核蛋白芯片檢測(P<0.05或<0.01)，特異度差異無統計學意義(P>0.05)。T-SPOT.TB檢測TBM的敏感度不同于曾劍鋒等[6]、韋海旭等[7]的研究， 也低于肺結核及結核性胸膜炎等其他結核性疾病[8-9]。γ干擾素是結核分枝桿菌感染后機體免疫應答中最重要的細胞因子[10]，在大多數免疫力正常的感染者中，獲得性免疫能夠控制卻不足以清除結核感染，吞噬了結核分枝桿菌的巨噬細胞被纖維包裹形成肉芽腫而使感染局限，這時機體呈現一種無癥狀的隱性感染狀態，而結核特異性記憶型T細胞在機體中長期存在[11]。機體再次感染結核菌后，受抗原刺激，記憶型T細胞能迅速活化增殖，釋放γ干擾素。本研究TBM較一般結核患者檢測陽性率低的原因，可能是部分TBM患者早期應用激素治療從而影響到細胞免疫反應，且γ干擾素表達水平與TBM病程有相關性[12]。

結核蛋白芯片是一種診斷結核的重要標志物，尤其對結核菌檢測陰性患者，但其對診斷TMB仍有其局限性[13]。本研究結果顯示結核蛋白芯片檢測的敏感度為48.78%(20/41)，低于其他結核性疾病[14-15]。可能是由于肺結核胞外菌體脫落復制直接刺激機體產生抗體[16]，另外在結核患者不同患病時間內體內抗體水平也不相同，故檢測得出的敏感度也不相同。

T-SPOT.TB檢測作為檢測TBM的酶免疫學方法，敏感度、準確度較高，但檢測價格昂貴，檢測時間較長；而結核蛋白芯片檢測方法簡便、快速。對于臨床癥狀不典型、抗酸桿菌檢測陰性的TBM病例，如果條件允許，二者聯合檢測是更有意義的診斷輔助手段。

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(本文編輯：趙麗潔)

2015-08-24；

2015-10-26

河北省科學技術研究與發展計劃(13277794D)；河北省科學技術研究與發展指導計劃(132777269)

呂翠環(1966-),女,河北石家莊人,河北省胸科醫院主任技師,醫學學士,從事臨床檢驗學研究。

R

B

1007-3205(2015)11-1345-03