生存因子Netrin-1對胰島的作用

劉晨霄(綜述),李　倩(審校)

(南京醫科大學附屬南京醫院內分泌科,南京210006)

生存因子Netrin-1對胰島的作用

劉晨霄△(綜述),李倩※(審校)

(南京醫科大學附屬南京醫院內分泌科,南京210006)

摘要：生存因子 Netrin-1在神經和血管的新生過程中均發揮重要作用。最近的研究發現，在胰島形成過程中，Netrin-1能通過激活整合素調節細胞的遷移、侵襲、增殖和生存，并具有和血管內皮生長因子一樣的促進血管生成的功能，刺激平滑肌細胞和內皮細胞有絲分裂。同時，Netrin-1能夠在新生的胰島中表達，并參與調節凋亡，保護胰腺損傷。生存因子Netrin-1對保存胰島細胞量及修復胰島功能提供新思路，對2型糖尿病的預防和治療具有深遠的意義。

關鍵詞：生存因子 Netrin-1； 2型糖尿病；胰島；細胞凋亡

糖尿病在全球呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康。目前研究認為胰島β細胞分泌胰島素不足在2型糖尿病發生、發展中起重要作用，胰島素分泌能力取決于β細胞的數量和β細胞的功能，胰島β細胞量減少是造成胰島素分泌能力絕對下降的重要因素，β細胞量減少在2型糖尿病的發病機制起著重要的作用[1]。研究表明，生存因子Netrin-1在胰腺發育過程中能促進胰島細胞及胰周血管新生[2]，避免炎性因子損害[3-7]。為糖尿病的預防和治療提供新的思路，現綜述Netrin-1 對胰島的作用。

1Netrin-1及其受體

Netrins是最早發現的可溶性軸突導向因子，是一類結構高度保守且與層粘連蛋白相關的蛋白質，Netrins的發現可以追溯到20世紀末圣地亞哥研究者提出的理論[8]，隨后有研究者從體外膠原凝膠中證明神經管能分泌一類特異性吸引軸突向底板方向生長的蛋白質,隨后研究者在秀麗線蟲(c．elegans)中發現神經導向基因,其中一個是UNC-6，編碼分泌性蛋白，與層粘連蛋白有序列同源性[9]。已證實有3種分泌型 Netrin 蛋白：Netrin-1、Netrin-3、Netrin-4 (也稱為 β-Netrin)，還有兩種位于細胞膜上的糖基磷脂酰肌醇錨 Netrins家族成員：NetrinG1和NetrinG2[10]。分泌型 Netrins 與其單鏈跨膜受體結合發揮作用[11]。其5個受體包括：結腸癌缺失基因 (deleted in colorectal carcinoma,DCC) 及其類似物 neogenin、UNC-5 同源物、唐氏綜合征細胞黏附分子[10]和腺苷 A2b 受體(adenosine 2b receptor，A2b)[12]。

Netrins最重要的功能是在神經系統發育過程中起雙相軸突導向作用——吸引或排斥[13]，目前對 Netrins中Netrin-1 的功能和表達研究最多[14]。近年來發現，Netrins及其受體在非神經組織中也廣泛表達并發揮重要作用，已證實 Netrin-1 可以影響乳腺的發育[15]、調節肺形態形成、保護心臟對缺血/再灌注損傷[16]等。同時作為生存因子，Netrin-1可能在血管形成的過程中起著內皮導向因子的作用。

2Netrin-1及其受體在胰腺的表達

Netrin-1在胰腺上表達。Yang等[17]證實在成年大鼠的胰腺上可以表達Netrin-1的所有基因，并且在成年大鼠及人體胰腺上發現其受體，近年研究結果也提示胰島除了表達和分泌經典的激素外，還分泌Netrin-1[18]。

Breuck等[18]建立妊娠大鼠模型，經過Western blot分析證實，在幼鼠腦組織中 Netrin-1 抗血清在大約Mr 78區域呈現一蛋白條帶，并觀察在幼鼠胰腺組織中E20附近也有同樣的蛋白條帶表達，但是在E21區域蛋白條帶很模糊，成體鼠胰腺組織中檢測不到 Netrin-1蛋白。結扎成體大鼠的胰腺管，在結扎后的第 3、5、7 日分別觀察發現在部分胰腺上Netrin-1 蛋白重新表達，特別是在腺管結扎后的第5日表達量明顯增加。經逆轉錄-聚合酶鏈反應證明， Netrin-1 mRNA存在于所有胰腺組織中，并且所有類型的胰腺上皮細胞均可以合成 Netrin-1。

人的胰島分泌 Netrin-1 并不依賴于高血糖的刺激，胰島分泌的胰島素和 Netrin-1 均儲存于特定的分泌囊泡中,這一過程依賴α細胞和β細胞上的 Netrin-1 受體 (Neogenin,UNC5A 和 UNC5B)。

3Netrin-1 促進胰島組織形成和胰周血管新生

3.1Netrin-1促進胰島組織形成 胰腺的上皮細胞(內分泌部和外分泌部)由原始腸上皮細胞分化形成。這個過程首先始于脊索與內胚層的中線直接接觸，導致背芽(胎齡8.5 d；大鼠第13 體節)和腹芽(胎齡10.5 d；第30 體節)外翻。胰腺上皮細胞(兩種胰腺原基)與間質組織分泌的細胞外基質、生長因子和其他信號分子的相互作用，引起了細胞增殖、胰腺形態發生以及胰腺內分泌細胞和外分泌細胞分化的高峰。研究提示Netrin-1或許在胰腺形態形成及細胞遷移方面發揮了作用[19]。在發育中的胰腺上，Netrin-1 是由導管內未分化的上皮細胞、胰島及腺泡表達。分泌的Netrin-1結合在基膜細胞外基質上，促進胰腺上皮細胞黏附和胰腺前體細胞的遷移。

研究發現Netrin-1在大鼠妊娠末期即胰島形態形成的關鍵時期表達，在新生大鼠和成年大鼠體內檢測不到其蛋白表達。然而，在胰腺損傷模型(結扎胰管)中胰島再生及胰腺組織重塑，伴隨著Netrin-1表達，免疫組織化學也進一步證實其在再生胰腺組織上呈高表達，在正常胰腺組織中呈陰性，提示其機制是由于Netrin-1促進上皮細胞從外分泌組織向內分泌組織遷移，但目前對上皮細胞遷移能力及其分子調節機制研究尚不成熟。進一步探索Netrin-1對體外胰腺上皮細胞遷移的影響，在共培養的Transwell 小室中加入10×103pg/L Netrin-1，結果較對照組發生遷移的細胞數明顯增加，并且細胞遷移能力與Netrin-1的劑量存在一定相關性[18]。

探索Netrin-1通過何種受體黏附于發育中的胰腺上皮細胞,研究者發現了一個有趣的現象: 胰腺上皮細胞需依賴受體DCC黏附在 Netrin-1 的 Ⅴ、Ⅵ的結構域上，進而維持脊索上聯合軸突的生長和其定向性。但是胰腺上皮細胞卻可以直接黏附在 Netrin-1 C端來源的肽段上，已經證實這個結構域也可以與肝素結合，并且可能參與了Netrin-1與細胞外基質結合的過程[20]。

α6β4與層粘連蛋白或 Netrin-1 結合后，通過酪氨酸激酶家族激酶引起β4亞基異常大的胞質尾端磷酸化，進而激活信號通路[涉及到Src同源結構域連接蛋白募集、腎素-血管緊張素系統活化和絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶磷酸化]，調節細胞遷移、侵襲性、細胞增殖和生存。在胰腺上皮細胞上，α6β4是唯一與 Netrin-1 黏附的整合素受體，這提示，這種相互作用在胰腺發育過程中可能發揮了重要的信號功能。

3.2Netrin-1 促進胰周血管新生Netrin-1對血管新生起反饋調節作用。研究者認為Netrin-1在胰腺周圍血管新生與上皮細胞遷移、黏附過程中發揮促生存因子的作用[21]。

Netrin-1 通過其定植在毛細血管上的受體 UNC5b 在血管形成過程中發揮排斥性作用，在 UNC5b 受體功能缺失的突變鼠體內，觀察到了過度分支的血管、過度擴展絲狀偽足的內皮細胞，使用動脈內皮細胞培養系統表達 UNC5b，研究者發現擴展絲狀偽足的內皮細胞減少，在敲除Netrin-1 同源物(反義寡核苷酸誘導)的斑馬魚新生血管中也發現類似的異常分支[22]。因此，認為 Netrin-1-UNC5b 途徑或許在胚胎發育期通過限制內皮細胞絲狀偽足過度擴展調節血管生成。同時，Netrin-1 與細胞外環境的其他成分(如細胞外基質和生長因子等)相互作用從而確保血管有序延伸、生長。

采用斑馬魚或哺乳動物模型，功能獲得或敲除相關基因，通過離體和在體試驗都得出了相同的結論：Netrin-1是一種促血管生成的因子。并通過阻斷小鼠髂動脈造成后肢缺血模型[23]，發現 Netrin-1 有和血管內皮生長因子一樣的促進血管生成的功能，增加新生血管中平滑肌細胞向內膜聚集，但這種血管生成的影響可能在胚胎期和新生內皮細胞中及體內和體外不同條件下存在差異性。而在糖尿病模型中，Netrin-1能促進內皮細胞的增殖，增加神經周圍血管密度，提高神經傳導速度，此外，還能刺激施萬細胞的增殖；與血管內皮生長因子相比，Netrin-1 更能提高神經傳導速度，提示其神經、血管雙重功效在糖尿病中潛在的治療優勢。最近，Tu等[24]提出內皮細胞跨膜蛋白的免疫球蛋白超家族成員CD146也是Netrin-1受體，Netrin-1能通過與其結合促進血管新生。胰周血管為胰腺及胰島組織提供營養，Netrin-1 是否參與胰周血管的形成發育尚無足夠依據，前僅有少量的文獻報道 Netrin-1 在胰腺再生及與胰腺血管的作用。

4Netrin-1 抑制 β細胞凋亡

高血糖導致胰腺細胞凋亡,并使胰島移植產生困難。在缺乏Netrin-1時，UNC5H2 和 DCC 表達上調將導致凋亡細胞增多；當外源性 Netrin-1與UNC5H2 或 DCC 結合后，這種作用被抑制。隨后，他們證實 UNC5H2 和 DCC均是胱天蛋白酶3 (caspase-3) 的基質，UNC5H2和DCC的胞質內序列(特別是UNC5H1,UNC5H2 和 UNC5H30)是已知的“亡構造域”，能募集并激活caspase-9，在胰島β細胞中，caspase-9 是凋亡中的啟動和效應胱天蛋白[25]，繼而進一步激活caspase-3。UNC5H促凋亡可能是通過依賴絲氨酸/蘇氨酸激酶的死亡相關蛋白激酶和色素瘤相關抗原家族的同系物蛋白來激活caspase級聯反應的凋亡過程。最近，有研究發現DCC調節細胞凋亡可能與脂質的棕櫚酰化和再分配相關，但具體機制尚不清楚。

也有研究表明，Netrin-1及其受體表達受p53的直接調節，其中，Netrin-1受體基因UNC5H2已被鑒定為p53的靶基因，并被命名為p53RDL[26]。UNC5基因在不同的轉化細胞表達導致培養基中細胞生長受到明顯抑制，減少基膜基質的浸潤，誘導凋亡，而加入Netrin-1后這些效應消失。Yang 等[17]認為，Netrin-1 及其受體的表達水平似乎存在一種年齡相關性，這種表達提示在胰腺內存在 Netrin-1 的自分泌或旁分泌路徑，Netrin-1過表達導致 neogenin 蛋白下調表明胰島內有 Netrin-1 自分泌信號存在。neogenin和UNC5與Netrin-1結合后，降低了caspase-3的活性，特別是在高糖環境下這種作用更為明顯[27]，這與之前證實 Netrin-1對其他細胞如胃上皮細胞，神經上皮細胞及乳腺細胞具有促活作用是一致的[28]，并且Yang 等[17]認為這種凋亡作用與下游的信號通路Akt、ERK、ASK1相關。

5Netrin-1 抑制炎性因子對胰腺的損傷

最近在體內和體外試驗中，研究者發現 Netrin-1 似乎具有抑制白細胞從上皮細胞游出的作用，因此可以控制炎癥，此外，在一些動物模型上也表明其可以調節炎癥反應，減輕局部組織損傷，包括急性結腸炎[3-5]、急性肺損傷、腹膜炎[3,6]及順鉑誘導的腎臟損傷[7]等，提示在胰腺炎癥中 Netrin-1 也可以發揮類似的保護作用。

Chen等[27]在急性胰腺炎模型(精氨酸誘導)，觀測到Netrin-1 組較對照組體內中性粒細胞滲出明顯減少，血漿炎性因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6 水平下降，而IL-10 水平明顯升高，淀粉酶水平及髓過氧化物酶活性降低，受損傷的胰腺組織得到改善。現認為，UNC5b 或者腺苷 A2b 受體信號通路參與抑制白細胞聚集和炎癥反應[29]，已證實UNC5在多種白細胞簇上表達，這種受體能抑制粒細胞和淋巴細胞遷移[30]，腺苷 A2b抑制中性粒細胞向體內、外遷移[31]。值得注意的是，Bhama等[32]發現在肥胖的人體及大鼠內的Netrin-1只選擇性地在內臟白脂肪中增加，其在血清中并不改變，與瘦的個體相比循環中的Netrin-1也只是中度下降，白脂肪中的炎癥涉及到IL-6聚集、脂解率和肝葡萄糖生成增加[33]。減少循環中的Netrin-1能夠調節腎臟缺血/再灌注過程中的炎癥反應[29,34]，并且上皮細胞過表達Netrin-1能夠降低低密度脂蛋白受體缺失小鼠發生動脈粥樣硬化的風險[35]。Moore 等[11]認為Netrin-1通過激活環腺苷酸通路，活化反應結合蛋白，繼而抑制免疫細胞產生炎性因子。Netrin-1 調節炎癥反應涉及到過氧化物酶體增殖物活化受體，各種類型的脂肪酸花生四烯酸的代謝產物可以綁定并激活過氧化物酶體增殖物活化受體[36]，Netrin-1與其結合促進巨噬細胞極化狀態向選擇性活化的M2表型轉化[37]，發揮抗炎、保護組織損傷的作用，并抑制干擾素γ誘導巨噬細胞表型經典活化的M1型活化，減少循環中炎性介質IL-6、IL-10等的釋放[36]，同時通過抑制核轉錄因子抑制蛋白降解，阻止核因子κB通路活化，核因子κB是已知的環加氧酶通路調節器，調節環加氧酶2的表達、前列腺素E2的產生[38]，核因子κB可促進多種細胞因子的基因轉錄[39]，數據表明核因子κB激活會下調炎癥時Netrin-1的表達，但外源性的 Netrin-1 不會抑制核因子κB的表達[38]，要進一步闡明炎癥時 Netrin-1 與 核因子κB之間的關系尚需要從除了表達水平以外的多方面進一步研究。

6展望

Netrin-1作為一種新的生存因子，在血管和神經的發生、發育中起著重要作用，其受體在胚胎期和損傷后的胰島中均廣泛表達，并能調控胰島部位的炎性因子的作用。但是，迄今為止還有許多問題尚待解決，特別是Netrin-1如何影響胰島細胞量，其作用通過何種機制起作用等。這些需要再進一步研究，將為糖尿病發病機制提供新的理論依據，同時為糖尿病的預防和治療提供新的策略，對人類戰勝糖尿病具有深遠的意義。

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The Effect of Survival Factor Netrin-1 on Islet

LIUChen-xiao,LIQian.

(DepartmentofEndocrinology,NanjingHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210006,China)

Abstract：Netrin-1,a survival factor,plays a major role in the development of neurogenesis and angiogenesis.Recent studies have shown that Netrin-1 transduced through the activation of a6β4 integrin regulating cell migration and invasiveness,cell proliferation during islet formation.Netrin-1 is also involved in promoting angiogenesis like vascular endothelial growth factor,stimulating mitogenesis of vascular smooth muscle and endothelial cell lines.At the same time,Netrin-1 can activate islet neogenesis,modulate cell apoptosis and protect the pancreas from injury.Survival factor Netrin-1 has significant role in preserving islet mass and repairing pancreatic cells,which provides a novel avenue for prevention and treatment of type 2 diabetes mellitus.

Key words：Netrin-1; Type 2 diabetes mellitus; Pancreas islet; Apoptosis

收稿日期：2015-03-24修回日期：2015-05-22編輯：相丹峰

基金項目：國家自然科學基金(81200594)；南京市醫學科技發展項目(ZKX14037)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.005

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4236-04