血管生成三維培養模型的研究進展

任榮梅(綜述),白　懷(審校)

(四川大學華西第二醫院遺傳代謝性疾病及圍生醫學實驗室，成都 610041)

分子生物醫學

血管生成三維培養模型的研究進展

任榮梅△(綜述),白懷※(審校)

(四川大學華西第二醫院遺傳代謝性疾病及圍生醫學實驗室，成都 610041)

血管生成或血管新生是指從已有血管長出新血管的過程。機體在生理狀態，如胚胎發育、組織再生以及病理狀態(如腫瘤、糖尿病視網膜病變、類風濕關節炎等)均有血管新生。血管生成是內皮細胞的重要功能。傳統單層細胞培養(2D培養)模型所取得的研究結果和體內的情況并不符合；動物模型的使用雖然具有其優點，但由于體內多種因素的制約以及體內和外界環境的相互影響,難以研究單一過程；三維培養(3D培養)模型可使細胞呈立體生長,更接近于體內自然生長狀態，有利于研究細胞-細胞的相互作用，以及旁分泌對細胞的作用。血管生成3D培養系統的建立，已成為向著構建組織器官特異性3D血管生成模型目標邁進的關鍵環節。現對血管生成3D培養模型的研究進展進行綜述。

13D培養與2D培養的比較

2D培養即在體外細胞單層培養，細胞呈片層樣生長。利用2D培養，可以做一些基礎的細胞生物學方面的研究，如細胞的形態結構以及細胞對環境理化刺激的應答反應等研究。然而，體內的細胞不像二維一樣單層生長，如要研究細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用以及作用機制等用2D培養難以達到研究目的。

近幾年3D培養技術在組織形成、血管發育和器官再造、腫瘤等領域得到了廣泛的應用，同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗等方面也顯示出了重要的價值。

2生物材料

生物材料應具有天然組織的適應性，以利于細胞附著、存活、增殖和分化。多數3D培養模型均使用天然蛋白性材料，如Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白或富含層粘連蛋白膜性基質提取物，這些材料來源廣泛并容易操作。此外，天然材料攜帶多種內源性信號，有利于細胞的存活，并且能有效地促進形態發生，如乳腺癌的形態發生[2]﹑內皮細胞毛細血管形態發生[3]和出芽[4]等。但天然蛋白3D支架也存在不足之處，如對其降解難以調控、機械穩定性不夠，且存在產品批次間的差異等。近年來人們傾向于使用合成材料作為支架，其優點是易于進行化學修飾，也能很好地控制支架的化學成分和機械性能。

應用合成材料建立的3D腫瘤模型已有一些報道[5-7]。通過一定的配體交聯方法和特定支架相配合獲得的合成基質能控制支架硬度和黏附配體的濃度比例；合成支架的降解性可以人為控制達到需要的穩定性時間，這能通過在支架中引入特異的金屬蛋白酶位點或特定性化學基團而實現[8]。此外，合成支架可以傳遞多種生長因子的活性，以介導細胞的命運[9]。但天然和合成支架均存在很高的含水量(高于90%)，而致其致密度偏低，為準確模擬腫瘤的外環境，致密程度更高的支架才能與抗腫瘤藥物在體內生理性環境滲透特性相當[10]。

3培養分類

3D培養模型的種類較多，概括起來可以分為靜態培養和動態培養兩大類。

3.1靜態培養3D靜態培養的原理是將細胞直接接種于3D支架材料中，讓其靜止生長培養。細胞懸浮培養和球狀聚集培養是其代表。

3.1.1靜態細胞懸浮培養近年Nyga等[10]建立了膠原蛋白3D摸擬結腸癌血管新生模型，在含有人HT29結腸腺癌細胞的膠原蛋白基質中加入一定的可塑性材料，使膠原密度提高6倍，這種高密度膠原模擬組織的缺氧核心，在其外圍非致密的膠原中種植人臍靜脈內皮細胞和結腸成纖維細胞系CF56，經過21 d培養，中心處腫瘤細胞發展為缺氧腫瘤團塊，而內皮細胞向內遷移到核心結構的外層。然而，該模型的缺點是形成的血管結構不明顯，且外圍非致密的膠原蛋白支架會發生收縮而出現分層。

Ingthorsson等[11]應用Matrigel支架研究了內皮細胞對人乳腺上皮細胞生長與分化的影響，發現內皮細胞刺激正常和腫瘤乳腺上皮細胞分化和克隆形成效能，其作用經可溶性因子介導。但在整個實驗過程中內皮細胞仍保持圓形的靜止狀態，未見血管結構形成。該模型不適宜直接觀察內皮細胞和上皮細胞的相互作用。

此外，Verbridge等[12]報道了口腔鱗癌細胞影響血管新生的膠原蛋白3D模型。這種模型是將內皮細胞種植于含腫瘤細胞的膠原蛋白表面，培養3 d后，內皮細胞向膠原中的腫瘤細胞方向侵入，提示腫瘤細胞對內皮細胞具有化學趨化作用。近年還發展出了雙層生物工程化血管新生模型，該模型使用端粒酶永生化微血管內皮細胞，將其種植于Ⅰ型膠原水凝膠表面，水凝膠層之下為種植于Ⅰ型膠原內的MDA-MB-231或人乳腺癌細胞[13]。研究發現，兩種細胞僅MDA-MB-231細胞能介導內皮細胞增殖并侵入到膠原蛋白層，形成復雜的網狀毛細血管樣結構。

尿白蛋白／尿肌酐與α1微球蛋白及C反應蛋白對早期糖尿病腎病的診斷價值…………………… 何云英 朱敏 蔣玲霞 等（1）117

3.1.2靜態細胞球狀聚集培養與常規的懸浮細胞培養和單層細胞培養相比，腫瘤細胞球狀聚集培養可以復制原始組織的形態和功能特性[14-15]。腫瘤細胞在球狀結構中的生長慢于單層培養細胞，在3D球狀細胞結構中包含外增殖層、中靜止層和內壞死細胞層3個區域。各區域腫瘤細胞的反應特性依腫瘤的大小而不同[14,16]。有研究利用厚層mitrigel，挖去其中一部分后，填入懸浮于Ⅰ型膠原的卵巢癌細胞，然后與培養基中含內皮細胞和肌成纖維細胞一起培養，48 h后培養基中的上述細胞圍繞腫瘤細胞發生黏附和遷移，表面的細胞向腫瘤細胞處移動，形成管樣結構，最后侵入腫瘤細胞簇；對腫瘤血管形成的分析發現，內皮細胞在侵入腫瘤細胞簇的過程中，肌成纖維細胞起支持作用。還有利用球狀培養模型進行早期腫瘤血管新生的研究，即在膠原蛋白基質中培養內皮細胞、成纖維細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞，2 d后可見乳腺癌細胞促進毛細血管芽狀結構形成[17]，這些芽狀結構能對一些特定抗血管生成藥物發生應答反應，該研究還發現基質細胞支持內皮細胞在血管生成過程中的侵入作用，提示臨床前藥物的篩選模型中應加入基質細胞。此外，另一項基于相同方法的研究模型，是利用臍靜脈外植體和埋于Matrigel中的前列腺癌細胞聚集體的共培養[18]，培養20～25 d后可觀察到腫瘤細胞簇刺激微血管外生，而不需添加外源性生長因子，此模型適用于篩選抗腫瘤藥物，與小鼠主動脈環和常規細胞培養方法相比其敏感性更高。

為了克服基于細胞外基質來源的基質存在的固有缺陷，另一實驗小組開發了半合成性starPEG-heparin水凝膠作為組織工程化材料，該系統具有可調控細胞微環境的特性，其機械性特征的變化與生長因子、黏附配體和可降解多態序列等生物性功能分子之間的關系可以人為加以控制，上述水凝膠與細胞外基質的相似之處在于可以同時附著和存貯多種生長因子，特別適用于腫瘤與血管生成關系的研究[19]。

3.2動態培養剪切力和血液流動在血管化過程和新生成的血管芽狀結構的維持等方面起重要作用。微流體裝置能模擬活體的微環境結構，可控制物質的運輸和可溶性分子的時空傳遞，并能適時監控同類或異類細胞與細胞間的相互作用，因而優于傳統的體外實驗系統[20-21]。有研究小組制備了中心種植有內皮細胞的微流通道，其周圍由含有MDA-MB-231細胞的Ⅰ型膠原所圍繞[22]。通過施以腫瘤血管內相當的液體剪切力3 d，腫瘤細胞對與其共培養的內皮細胞產生應答反應，促血管生成基因的表達增加。

另外，Moya等[23]研發了另一種微流體模型，這種模型使用纖維蛋白或Ⅰ型膠原作為基質，其內種植有內皮集落形成細胞來源的內皮細胞，形成連續的微血管灌流網絡，基質內同時含有共培養的結腸癌SW620細胞；該系統內可加入基質細胞，如正常人肺成纖維細胞[24]或ips-來源的心臟肌細胞[23]。

Shin等[25]和Chung等[26]研發了3D和2D相結合的微流體模型，應用該模型可研究空間和時間上細胞-細胞之間和細胞-細胞外基質之間的相互作用。Moll等[27]建立了用于外周神經髓鞘腫瘤研究的3D組織化腫瘤模型，該模型使用一段脫細胞的豬空腸段，在其頂端種植上原代成纖維細胞和S462腫瘤細胞，微血管內皮細胞種植于其底部和側面，將種植有細胞的支架放置于流動的生物反應器中，使細胞暴露于剪切力14 d后，在組織學上觀察不同細胞群的反應特性。這種支架的優點是保存有原血管結構，并能新種上血管內皮細胞，且保存有細胞外成分和結構。該模型有利于觀察細胞黏附和組織分化。

總之，3D腫瘤動態血管新生模型能重現基本血管單位——毛細血管結構，以及一定程度的腫瘤生長。但該領域的研究尚處于初期階段，未見有相關應用方面的研究報道。

4理想的培養模型

2005年來血管生成模型方面以腫瘤血管生成模型的研究進展尤為顯著，雖然建立了很多新的復雜模型,但新模型尚有很多地方需要完善。理想的腫瘤血管生成模型應重現腫瘤的生理環境，即能對3D支架從生理、化學和生物學特性等方面加以控制，并能適時觀察血管化過程中腫瘤微環境所發生的變化。要達到這些要求，以下方面尤為重要。

4.1材料不同類型腫瘤的基質成分在構成種類及其含量上均有不同[28]，構建腫瘤血管成生成模型因而具有相應的差別；此外，腫瘤基質成分在腫瘤發展過程中會發生由纖維蛋白樣轉變成膠原蛋白樣的變化。在構建新腫瘤血管生成模型時還應考慮特定腫瘤微環境和血管生成過程相一致的環境。迄今多數3D模型均使用Ⅰ型膠原，其他天然材料，如透明質酸、繭絲和合成支架等已應用于血管仿生領域[29-30]，這些材料在3D培養血管生成模型中的應用有待探索。

4.2細胞種類腫瘤細胞微環境含有多種細胞，其構成細胞的種類依特定腫瘤類型的不同而不同。理想的模型應包括活體特定環境中所有的細胞種類。迄今多數3D腫瘤血管生成模型使用的細胞僅為腫瘤細胞和內皮細胞[11-13]。但很多研究均提示，間質成纖維細胞參與調節腫瘤侵入和血管生成，這類細胞應加入3D腫瘤血管生成模型中[17,31-32]。其他類型的細胞(如炎性細胞)加入到模型中，可以確定其在腫瘤血管生成中的作用。此外，來源于不同組織的內皮細胞在形態、標志分子的表達和代謝特性等均有不同[33]，還存在有與親代腫瘤細胞相同的自發性突變等問題[34]，因而細胞來源在設計3D模型時也應加以考慮[35]。多數3D模型均使用的是永生化細胞株，未包含腫瘤干細胞或循環腫瘤細胞[36-37]，因此，在3D模型中應使用患者標本來源的原代腫瘤細胞，有利于研究其生長及長期存活。為增加實驗模型所獲結果的預見性效力，使用患者自體來源的細胞以用于個性化的藥物試驗將是未來努力的方向。

4.3結構特性實體腫瘤組織的結構為由基質圍繞腫瘤實質所構成[38]。腫瘤的結構依賴于腫瘤類型及其進展階段有所不同。目前多數3D模型仍然采用隨機方式將細胞種植于基質內。通過3D微圖形成型技術、光刻技術和微形打印技術[39]等方式可以獲得期望的細胞空間排列的結構。這些新方法的使用有助于達到自由控制不同細胞群與群之間的距離以及相互作用類型的目的，同時在時空上給予生物化學和生物物理性刺激[20]。

4.4培養條件傳統的3D血管新生模型一般是靜態模型，近年在此基礎上發展出了組織工程化動態微流模型，該模型已開始用于腫瘤研究。理想的腫瘤血管生成3D模型應包括模擬血流的動態成分，因為活體狀態內皮細胞連續地暴露于剪切刀和組織間液的流動，循環系統對抗腫瘤藥物的運輸是通過組織間液的流動而實現，且液體的流動能產生可溶性因子的濃度遞變幅度[40]。目前對添加可溶性因子(如血管內皮生長因子)在腫瘤血管生成研究領域的使用目前還存在爭論。此外，長期3D培養對細胞活性的維持也是一個問題，高細胞密度的培養要求研制新的裝置以克服氧產生的不足或代謝廢物的積聚。

4.5分析方法目前對多數3D模型實驗結果的分析仍采用描述性的方法，如常規的顯微分析法及共聚焦顯微分析法等[41]。將來期望從實驗結果中獲取更多的數據用于分析。進一步建立高解析力的4D顯微分析技術，有助于對腫瘤環境中血管生成事件加以詳細的記錄；對腫瘤細胞募集、細胞間相互作用和刺激新的血管結構形成等動態性觀察會增進人們對腫瘤血管生成的深入理解。開發3D和4D顯微成像獲取數據的自動分析系統，有助于避免結果的偏差，并簡化和加速數據的分析過程。此外，為更詳細記錄3D腫瘤模型的影像，還必須建立穩定的熒光蛋白表達細胞系(如腫瘤細胞、內皮細胞和其他細胞系)，并克服現在使用的細胞示蹤分子穩定性較低及存在毒性的問題。

5結語

2005年來3D組織工程領域取得了很大的進展，已研究出一些新的能控制生化和生物物理特性用于血管生成模型研究的新方法。已有的3D腫瘤血管生成模型雖然包含有細胞和無細胞成分，但并未能完全模擬腫瘤微環境的異質性。新一代3D血管生成模型應更加注重生理上精確模擬活體組織的特性，以獲得準確的實驗結果。研發新的3D培養模型有助于增進對腫瘤血管生成機制的理解以及提高抗腫瘤藥物的開發效率。

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摘要：血管生成是內皮細胞的重要功能，在胚胎發育、組織再生、炎癥﹑腫瘤的生長與轉移等多種生理和病理過程均有血管生成。傳統的單層細胞培養(2D培養)模型是迄今最常用的體外實驗研究模型，但存在諸多的不足，如細胞的生長特性與體內差異較大等。三維培養(3D培養)模型上細胞呈立體生長,更接近于體內的自然生長狀態。3D培養已經發展出了多種方法，特別是近年組織工程技術的應用，3D血管生成模型的建立取得了很多新進展，在腫瘤領域的相關研究尤為活躍。

關鍵詞：血管內皮細胞；血管生成；三維培養

Recent Advances in Three-dimensional Models of AngiogenesisRENRong-mei，BAIHuai.(LaboratoryofGeneticMetabolicDiseaseandPerinatalMedicine,SichuanUniversityWestChinaSecondHospital,Chengdu610041,China)

Abstract:Angiogenesis is an important function of endothelial cells,which participates in physiological and pathological processes,such as embryo development，tissue regeneration,inflammation,tumor growth and metastasis.Monolayer(two-dimensional,2D) cell culture models are the traditional culture models widely used for in vitro experimental cell research.However,these models have several drawbacks,such as cell growing differs greatly from naturally grown cells.Cells growing in three-dimensional(3D) matrix is closer to growth in vivo.In recent years 3D culture has developed a variety of novel methods,especially in combination with utilizing tissue engineering technology.A lot of progress has been achieved in 3D in vitro angiogenesis model,especially in the tumor research field.

Key words:Vascular endothelial cells; Angiogenesis; Three-dimensional culture

收稿日期：2014-11-03修回日期：2015-01-19編輯：相丹峰

基金項目：國家自然科學基金(81271733)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.16.001

中圖分類號：R363

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)16-2881-04