線粒體DNA損傷與視網膜色素上皮細胞關系的研究進展

俞永珍，鄒秀蘭，鄒玉平

綜述

線粒體DNA損傷與視網膜色素上皮細胞關系的研究進展

俞永珍，鄒秀蘭，鄒玉平△

線粒體DNA（mtDNA）是線粒體內具有遺傳效應的雙股閉環DNA分子，對細胞及其功能具有重要作用。視網膜色素上皮（RPE）細胞活動亦由大量線粒體參與。因RPE細胞代謝活躍，當發生氧化應激時可引起線粒體及mtDNA損傷；當線粒體及mtDNA損傷無法及時修復而使損傷積累，可引起RPE及線粒體功能障礙，并誘發啟動細胞凋亡，進而引發某些眼病，如年齡相關性黃斑變性等。現就mtDNA與RPE細胞的功能關系、mtDNA損傷修復及檢測方法作一綜述。

DNA，線粒體；DNA損傷；視網膜色素類；上皮細胞；活性氧；綜述

視網膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）是視網膜代謝最活躍的區域，由單層排列整齊的六面柱狀的色素細胞即RPE細胞構成，具有吞噬降解感光細胞外節段、轉運營養物質及代謝產物、清除自由基等功能，這對視網膜自平衡及視覺有極為重要的意義［1］。研究發現線粒體DNA（mito?chondrial DNA，mtDNA）的損傷與視網膜疾病密切相關，位于視網膜最外層的RPE細胞因長期暴露于光線刺激、高氧的環境中，易受到氧化損傷，產生慢性氧化應激，這種病理變化可導致光視性視網膜損傷等眼病［2-3］。以下就mtDNA損傷和修復及與RPE細胞的關系進行綜述。

1 mtDNA

1.1 結構與功能線粒體是存在于大多數真核生物體內的一種重要而獨特的細胞器，外膜完整包圍細胞器，內膜因向胞質內褶皺形成細胞嵴；細胞質內有酶類、內質網、核糖體及DNA。人類完整的mtDNA為一個包含有16 569個堿基對的環狀雙鏈DNA分子，能夠獨立地進行基因轉錄、翻譯及蛋白的表達。mtDNA編碼37個基因及13個蛋白質基因，其中編碼的13個亞基是線粒體復合物參與呼吸電子傳遞鏈所必需的，故mtDNA的轉錄調節對于機體的能量需求非常重要。

1.2 mtDNA基因組特性mtDNA進行基因轉錄、翻譯和表達時，具有遺傳多態性，并具有以下特點：首先，雙鏈DNA完全轉錄，無內含子，沒有高效的修復系統；其次，mtDNA編碼的基因沒有相關組蛋白及其他蛋白的保護；此外，mtDNA損傷效應極易積累；最后，線粒體具有遺傳異質性，即每個細胞有數百個線粒體，每個線粒體有多個DNA，因此一個細胞可同時具有正常和異常的mtDNA，從而可具有不同的遺傳特性［4］。由此可見，當mtDNA在高活性氧（reactive oxygen species，ROS）等氧化應激狀態下，容易使基因序列發生變化，進而使表達的蛋白發生改變，從而發生線粒體功能障礙及mtDNA損傷。根據mtDNA基因組的特性，與核DNA相比，mtDNA更易遭受氧化損傷，而且氧化應激反應對mtDNA的損傷比核DNA大10倍且更持久［5］。

2 mtDNA氧化損傷與RPE細胞

2.1 線粒體與自由基自由基是細胞內的正常產物，機體內自身存在產生-清除-抗氧化防御系統，細胞可通過酶類及抗氧化劑類，將產生的自由基清除或抵消。其中線粒體是體內氧自由基產生的主要場所，也是氧化損傷的靶細胞器。線粒體損傷與活性氧ROS的水平有關，其中mtDNA對氧化損傷更加敏感［6］。當ROS不能及時清除而積累于細胞中時，線粒體將受到氧自由基的攻擊，一方面可引起線粒體數量減少、腫脹變形，線粒體能量動力學改變；另一方面引起線粒體氧化呼吸鏈的功能障礙，導致ROS產生增加，可進一步誘導并促進細胞凋亡［7-8］。

2.2 RPE細胞與氧化損傷RPE細胞具有支持感光細胞、維持視網膜外屏障穩定、運輸營養物質等作用，故RPE所在區域代謝活躍，耗氧量高；且在RPE細胞內含有豐富的線粒體及溶酶體等亞細胞器。線粒體為RPE細胞提供代謝所需要的氧和腺嘌呤三磷酸腺苷（adenine adenosine triphosphate，ATP），因此在氧化呼吸過程中也生成了大量自由基。此外，RPE細胞屬于終末有絲分裂細胞，一旦視網膜色素上皮細胞受損或死亡，則不能再生，只能依靠鄰近的RPE細胞的擴張和移行來填補缺損區［9］。然而，RPE細胞內包含黑色素和脂褐素2種特殊類型的色素，通過吸收光線形成了一個輻射過濾裝置，從而保護了眼內細胞免遭高能量的氧化損傷。

黑色素主要是胚胎時期及出生后第1年逐漸合成的，可產生超氧陰離子（O-2）及H2O2。Boulton［10］研究發現藍光可誘導黑色素小體發生光動力反應而產生ROS。脂褐素是RPE細胞吞噬、消化感光細胞外節后的殘留物，當感光細胞外節受到光照刺激發生氧化應激時，脂褐素可產生不同的熒光基團［11］，其中N視黃基N視黃乙醇胺（N-retinylidene-N-retiny?thanolenrine，A2E）是最主要的熒光基團。研究表明脂褐素在光化效應中產生大量ROS，進而對體外培養的色素上皮細胞產生光毒性［12］。隨著年齡的增加，RPE細胞中的脂褐素不斷累積，脂褐素的光化學反應亦增強，主要通過A2E特異性破壞細胞結構及其他小分子結構，最終可導致RPE細胞及線粒體功能障礙，進而影響視網膜正常生理功能的發揮，這與年齡相關性視網膜疾病，如年齡相關性黃斑變性的發生密切相關［13］。

2.3 線粒體與RPE細胞凋亡Li等［14］認為凋亡是RPE細胞氧化損傷的主要機制。其中RPE細胞線粒體在調控凋亡的信號傳導過程中起重要作用［15］。研究證實，大量ROS未能及時清除時，機體發生的氧化應激反應可誘導線粒體膜電位降低，線粒體通透性轉換孔（mitochondrialpermeability transi?tion pore，MPTP）開放，線粒體細胞色素C釋放入胞漿［16］；同時線粒體MPTP能將Bax蛋白聚集在線粒體膜孔道周邊，使形成更大的MPTP，導致細胞質的高滲性，從而激活凋亡誘導因子、pro-caspase-3等細胞凋亡因子，由此觸發并激活細胞的凋亡系統，引起細胞凋亡［17］。

3 mtDNA損傷

3.1 衰老與mtDNA損傷衰老在機體表現為自身功能減退、內環境穩定能力及應激能力下降，其發展過程與線粒體功能異常關系密切，在線粒體主要以mtDNA形態變化、片段缺失、基因突變、mtDNA甲基化等生物學變化為主。早期Miquel和Cowoker提出線粒體損傷是細胞衰老和死亡的基礎。此外，線粒體產生的自由基對衰老也有促進作用。由線粒體釋放的信號分子，如鈣離子、ROS、ATP及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucletide，NADH）可通過調控代謝的狀態激活特定的細胞通路，進而引起信號的級聯反應，引發線粒體調控衰老的生物活動［18-19］。

3.2 視網膜mtDNA的損傷及修復盡管線粒體的功能障礙與視網膜有關，但關于視網膜內mtDNA的損傷及修復機制的闡述并不十分清楚。視網膜mtDNA的損傷多見于衰老及氧化損傷，損傷發生后常伴有8-羥基脫氧鳥嘌呤（8-oxodG）位點損傷，此時主要通過腺嘌呤DNA糖苷酶、變位酶γ等DNA修復酶及堿基切除的方式，抑制8-oxodG表達活性或被特異性切除，從而修復損傷的mtDNA。研究已證實年齡、ROS、mtDNA損傷的積累及氧化刺激等因素可導致mtDNA氧化損傷修復功能降低或抑制［20］，這可能主要與mtDNA修復酶活性降低及mtDNA損傷修復基因如8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1（8-oxoguanine-DNA glycosylate，OGG1）有關［21］。Rózanowski等［22］也認為，隨著年齡的增加，mtDNA的損傷不斷增加，而mtDNA修復酶的活性逐漸降低，mtDNA修復酶8-氧鳥嘌呤-糖基化酶基因及蛋白表達水平均下降。

3.3 mtDNA氧化損傷的檢測方法mtDNA氧化損傷的檢測方法主要包括免疫化學方法、高表型液相色譜、氣相色譜分析、電化學質譜學及聚合酶鏈式反應（PCR），如單鏈構象多態性、連接介導PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）［23］。實驗中mtDNA提取純化過程會對mtDNA造成人為的損傷，因此有研究人員提出了基因和基因組特異性PCR擴增，通過這種方法可以檢測到mtDNA的損傷及修復［24］。目前，該方法被應用到體內和體外的各種模型，以探測由于氧化應激導致的mtDNA損傷的特異性。其原理是：當DNA的雙鏈發生氧化損傷時，DNA聚合酶不能在PCR反應中起作用，從而降低基因組片段的復制。因此，只有那些DNA聚合酶正常工作的DNA模板才可以正常進行擴增。

由此可知，線粒體、mtDNA的結構和功能及RPE細胞的生理特性，決定了線粒體可產生大量以ROS為代表的自由基，并發生氧化應激反應。這可能是導致線粒體、mtDNA及RPE細胞氧化損傷的主要原因之一。此外，衰老也與mtD?NA及RPE細胞的功能障礙密切相關。一旦損傷積累或損傷修復功能抑制或降低時，將嚴重影響線粒體、mtDNA及RPE細胞功能，從而誘發視網膜相關眼病的發生。

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（2014-08-10收稿2015-04-08修回）

（本文編輯李鵬）

The relationship between mitochondrial DNA damage and retinal pigment epithelium cells

YU Yongzhen，ZOU Xiulan，ZOU Yuping△
Department of Ophthalmology，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China；△

Mitochondrial DNA（mtDNA）is a genetic effect DNA molecule of double closed loop，and is crucial for cells and their functions.Mitochondria take an active part in physiological activities of retinal pigment epithelium（RPE）cells. The oxidative stress is usually occurred in RPE for its active metabolism，which can lead to mitochondria and mtDNA dam?age.Once mitochondria and mtDNA lesions have not been repaired timely，the lesions can be accumulated，which can cause dysfunctions and damaged-structures of RPE and mitochondria，and can motivate the progression of cell apoptosis.In the end it can result in some ocular related diseases such as aged-related macular degeneration（AMD）.This study reviewed the functional relationship between mtDNA and RPE，and repair and detection methods of mtDNA damage.

DNA，mitochondrial；DNA damage；retinal pigments；epithelial cells；reactive oxygen species；review

R774

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.034

廣東省科技計劃項目（2011B031800202，2012B031800409）

1廣州軍區廣州總醫院眼科（郵編510010）；2廣州醫科大學附屬第三醫院眼科

俞永珍（1989），女，研究生，碩士，主用從事眼底病研究

△通訊作者E-mail：gzzouyuping@sina.com