谷胱甘肽S轉移酶基因多態性與特發性男性不育精子DNA完整性相關性的研究

王歡，孫發，邢俊平，丁上書，孫超，王新陽，鄒鐵軍，唐開發，

（1.貴州醫科大學電鏡室，貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院泌尿外科，貴陽 550004；3.西安交通大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，西安 710061；4.陜西省人民醫院泌尿外科，西安 710068）

谷胱甘肽S轉移酶基因多態性與特發性男性不育精子DNA完整性相關性的研究

王歡1，孫發2，邢俊平3，丁上書3，孫超2，王新陽3，鄒鐵軍4，唐開發2，3

（1.貴州醫科大學電鏡室，貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院泌尿外科，貴陽 550004；3.西安交通大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，西安 710061；4.陜西省人民醫院泌尿外科，西安 710068）

目的探討谷胱甘肽S轉移酶基因M1、T1及P1（GSTM1、GSTT1及GSTP1）基因多態性與特發性男性不育癥患者精子DNA斷裂指數（DFI）的相關性。方法選擇特發性少弱精子性男性不育癥患者246例。采用聚合酶鏈反應及聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性方法，分別對GSTM1、GSTT1及GSTP1基因進行分型。采用吖啶橙染色標記流式細胞儀檢測精子DNA完整性，并計算DFI。結果GSTT1基因缺失型組特發性少弱精子性男性不育癥患者精子DFI顯著高于野生型組（P＜0.01）；而GSTM1基因缺失型組與GSTP1基因突變型組患者精子DFI與野生型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論GSTT1基因缺失型與特發性男性不育癥精子DFI呈正相關。

男性不育癥；谷胱甘肽S轉移酶；基因多態性；DNA斷裂指數

男性不育癥是指夫婦同居1年以上，未采取任何避孕措施，由于男性方面的原因導致女方不能受孕者［1］。男性不育癥患者中有30%的患者未發現明確的致病原因，發病機制及病理生理過程均不清楚，故稱之為特發性男性不育癥［2］。研究表明，精子DNA完整性比常規的精液分析能更準確地預測男性的生育能力，且不育癥男性中精子DNA損傷程度明顯高于正常生育的男性，精子DNA損傷可能是男性不育癥的負相關因素［3，4］。然而，精子DNA損傷的機制到目前尚不清楚。研究認為，環境因素（如活性氧）、遺傳因素及凋亡是導致精子DNA損傷的主要因素［5］。

谷胱甘肽S轉移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，屬于機體Ⅱ相解毒酶系統，其中編碼Mu、Theta和Pi亞型酶的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因在人群中存在功能性基因遺傳多態性［6］。本研究擬探討GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多態性與特發性男性不育癥患者精子DNA完整性的相關性，旨在為男性不育癥的發病機制及病理生理過程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：按WHO第4版標準，常規進行精液分析≥2次，結果符合以下標準者納入研究：睪丸體積在中國成人睪丸正常體積范圍內（15～25 mL）；精液量≥2.0 mL，精子密度＞5×106/mL～＜20×106/mL，A級精子百分率＜25%，且（A+B）級精子百分率＜50%；血清性激素水平在正常范圍內；有規律性生活1年以上，未采取任何避孕措施而女方未受孕。排除標準：性生活異常及具有可能影響精液分析參數的因素。通過以上納入及排除標準，共有246例患者納入研究。

1.1.2 主要試劑及儀器：全血基因組提取試劑盒（美國Axygen biosciences公司），2×PCR Mixture（立陶宛MBI公司）；Biomltra梯度PCR儀（德國Sigma公司），凝膠成像分析系統（美國BioRad公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和合成：根據基因序列，設計PCR擴增引物GSTM1：Forward 5′-GAACTCCCTGAAAAG CTAAAGC-3′，Reverse 5′-GTTGGGCTCAAATATAC GGTGG-3′，擴增產物長度219 bp；GSTT1：Forward 5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′，Reverse 5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，擴增產物長度480 bp；GSTP1：Forward 5′-ACCCCAGGGCTCTATG GGAA-3′，Reverse 5′-TGAGGGCACAAGAAGCCC CT-3′，擴增產物長度177 bp；內參照β-actin引物序列為：Forward 5′-ACTCCCCATCCCAAGACC-3′，Reverse 5′-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴增產物長度為400 bp［8］。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 外周血標本采集和基因組DNA提取：采取患者外周靜脈血3 mL，以乙二胺四乙酸二鈉作為抗凝劑混勻為抗凝血液，置于-80℃冰箱備用。基因組DNA提取按照外周血微量基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作，所提取DNA置于-20℃冰箱備用。

1.2.3 精液標本的收集及處理：所有研究對象禁欲3～5 d，用手淫、取精儀或體外排精法收集一次排精的全部精液，留于清潔收集器皿內，標明具體采集時間，置37℃培養箱內，待液化后備用。

1.2.4 GSTs基因型PCR擴增：采用Biomltra梯度PCR儀對所有DNA標本進行GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型檢測。反應體系為25 μL（2×PCR Mixture 12.5 μL，雙蒸水8.5 μL，1.0 μmol/L引物各0.5 μL，100 μg/μL DNA模板2 μL）。PCR擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統進行檢測。所有樣本均重復3次PCR擴增及電泳檢測。GSTP1基因PCR擴增產物采用BsmAI（ALW26I）限制性內切酶進行處理。

1.2.5 精子DNA斷裂指數（DNA fragmentation index，DFI）檢測：精液標本完全液化后，于冰上用TNE緩沖液（0.15 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L Na2EDTA，pH7.4，4℃），懸浮精子至（1～2）×106/ mL；對稀釋好的精液標本進行酸性裂解（0.08 mol/L HCl，0.15 mol/L NaCl，0.1%Triton-X 100，pH1.2，4℃）；加入吖啶橙染液（6 μg/mL吖啶橙，0.037 mol/L檸 檬 酸 ，0.126 mol/L Na2HPO4，0.001 1 mol/L Na2EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH6.0，4℃）；收集細胞并重新懸浮細胞；流式細胞儀檢測，488 nm激發光，單鏈DNA為紅色，雙鏈DNA為綠色。精子DFI= red/（red+green）×100%。重復檢測DFI 3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 精子染色質結構分析

精子吖啶橙染色熒光顯微鏡下所見及精子染色質結構分析流式細胞儀檢測結果見圖1、2。

2.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型鑒定

GSTM1基因擴增產物長度為219 bp，GSTT1基因擴增產物為480 bp，GSTP1基因擴增產物為177 bp，經BsmAI（ALW26I）限制性內切酶酶切后，野生型產物為177 bp，突變純合型后產物為87 bp及90 bp，突變雜合型產物為177 bp、87 bp及90 bp，β-actin內參照擴增產物為400 bp。見圖3、4。

2.3 GSTs基因多態性與精子DFI的相關性

圖1 精子吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察 ×40Fig.1 The sperms stained by acridine orange was observed under fluorescence microscopy×40

圖2 精子染色質結構分析流式細胞儀檢測Fig.2 Sperm chromatin structure assay detected by flow cytometry

圖3 GSTM1、GSTT1和GSTP1基因遺傳多態性水平凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis for glutathione S-transferase M1 and T1 gene polymorphism

圖4 GSTP1基因擴增產物BsmAI酶切后水平凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis for GSTP1 gene amplification products digestion by BsmAI enzyme

結果顯示：GSTM1（-）基因型亞組患者精子DFI與GSTM1（+）基因型亞組相比較，差異無統計學意義（P=0.063）；GSTT1（-）基因型亞組精子DFI明顯高于GSTT1（+）基因型亞組，差異有統計學意義（P＜0.01）；GSTM1/T1（-/-）基因型亞組精子DFI顯著高于GSTM1/T1（+/+）基因型亞組，差異有統計學意義（P＜0.01）；GSTP1（A/G+G/G）基因型亞組精子DFI與GSTP1（A/A）基因型亞組相比較，無統計學差異（P=0.347）。見表1。

3 討論

精液質量是評價男性生殖能力的基礎，為男性不育的診斷、治療及預后提供了重要的輔助信息。臨床上常常采用精液分析（包括pH值，精子密度、活力及形態）來評估男性的生殖能力［9］。然而，約15%的男性不育癥患者精液分析結果在正常范圍內，因此，對男性不育癥患者精子質量的評估往往不能僅依據精液分析［10］。研究發現，男性不育癥患者精子DNA損傷明顯高于生育的男性，高水平的精子DNA損傷，如精子數量、活力降低，正常形態精子減少，往往與較差的精液分析參數相關。精子DNA損傷也影響卵細胞漿內精子注射技術的成效［3，11］。因此，精子DNA損傷可能是導致男性不育的重要危險因素之一。

目前，導致精子DNA損傷的原因尚不清楚。研究認為，人類精子染色體在其組蛋白被魚精蛋白代替的過程中經歷了1次重要的重構，需要染色體組蛋白的乙酰化以及DNA拓撲異構酶Ⅱ，通過解旋DNA雙螺旋結構形成1個臨時的環，如果這些環沒有被修復，即形成了DNA碎片［12～14］。研究表明，精子DNA損傷與高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS）存在密切關系［15］。體內低水平ROS在精子成熟及功能（如精子獲能和頂體反應）中扮演著重要的角色。同時，精漿中的抗氧化物質可以保護精子DNA免受氧化損傷，而過多的ROS則會導致細胞和DNA損傷［16，17］。

GSTs是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，屬于機體Ⅱ相解毒酶系統，參與細胞對外源性化學物質、人工合成有機物質、ROS及其代謝產物解毒的各個生理階段［7］。前期研究發現GSTM1、T1基因缺失型精索靜脈曲張患者精子DNA完整性顯著低于其野生型［7］。本研究采用吖啶橙染色及流式細胞儀技術對特發性男性不育癥患者精子DFI進行檢測分析，同時對其GSTs基因多態性進行分型，結果發現GSTT1基因缺失型組精子DFI顯著高于野生型組，而GSTM1、P1基因多態性未發現與精子DFI存在相關性。本研究結果仍有待于多中心、大樣本進一步研究。

表1 特發性男性不育癥患者各GSTs基因型亞組精子DFI的比較Tab.1 Comparison of sperm DFI in each GSTs genotype of the patients with idiopathic male infertility

［1］World Health Organization.WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple［M］.Cambridge：Cambridge University Press，2000.

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（編輯 王又冬）

Correlation between Glutathione S-transferase Polymorphisms and Sperm DNA Integrity in Male Patients with Idiopathic Infertile

WANG Huan1，SUN Fa2，XING Jun-ping3，DING Shang-shu3，SUN Chao2，WANG Xin-yang3，ZOU Tie-jun4，TANG Kai-fa2，3

（1.Electron Microscope Lab of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；2.Department of Urology，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Medical College of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；4.Department ofUrology，ShanxiPeople′s Hospital，Xi′an 710068，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between glutathione S-transferase gene M1，T1 and P1（GSTM1，GSTT1and GSTP1）polymorphism and sperm DNA fragmentation index（DFI）in male patients with idiopathic infertile.MethodsThe study included 246 male patients with idiopathic infertility.Polymerase chain reaction（PCR）and polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）were used to identify the genotype of GSTM1，GSTT1and GSTP1，respectively.Sperm DFI was analyzed by flow cytometry with acridine orange staining.ResultsThe sperm DFI was significantly higher in GSTT1 gene null type group than in GSTT1gene wild type group（P＜0.01）；and there were no significant differences in GSTM1and GSTP1gene mutation type groups when comparing with the wild type group（P＞0.05）.ConclusionGSTT1gene deletion was positive associated with the sperm DFI in male idiopathic infertile patients.

male infertility；glutathione S-transferase；polymorphism；DNA fragmentation index

R698+.2

A

0258-4646（2015）12-1075-04

國家自然科學基金（81300541）；貴州省科學技術基金計劃項目{黔科合J字［2012］2054號}；貴陽醫學院附屬醫院博士基金（C-2012-6）

王歡（1977-），男，講師，碩士.

唐開發，E-mail：doc.tangkf@hotmail.com

2014-12-01

網絡出版時間：