小檗堿對2型糖尿病大鼠局部腦缺血組織中AQP4表達的影響

崔洪雨，梁馨予，盧怡君，王鵬，劉學(xué)政

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，沈陽 110847；2.遼寧醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

小檗堿對2型糖尿病大鼠局部腦缺血組織中AQP4表達的影響

崔洪雨1，梁馨予2，盧怡君2，王鵬2，劉學(xué)政1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，沈陽 110847；2.遼寧醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

目的研究2型糖尿病大鼠局部性腦缺血再灌注損傷時，小檗堿（BE）對AQP4表達及腦組織的保護作用。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、2型糖尿病大鼠腦中動脈阻塞再灌注組、假性治療組，BE治療組。制備腦組織切片作Nissl染色，觀察各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)缺陷，采用干濕重法測定缺血側(cè)腦半球的水腫度；蛋白印跡檢測BE對缺血周邊區(qū)腦組織中AQP4表達的影響。結(jié)果BE治療組神經(jīng)功能較模型組有明顯改善，神經(jīng)學(xué)評分明顯降低（P＜0.05），皮質(zhì)Nissl染色淡染區(qū)域減小（P＜0.05），缺血側(cè)腦半球干濕重比值明顯減小（P＜0.05），蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，BE治療組較模型組AQP4表達減少（P＜0.05）。結(jié)論BE可能通過降低AQP4表達水平降低腦水腫，從而對2型糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有保護作用。

小檗堿；腦缺血；2型糖尿病；AQP4

缺血性腦卒中是糖尿病死亡和致殘的主要原因之一，糖尿病也是腦卒中近年來發(fā)病率迅速增長的危險因素，糖尿病所引發(fā)的血管功能障礙和病理重塑等提高了心血管疾病的死亡率和發(fā)病率［1］。在近些年的腦卒中患者中，70%左右有糖尿病史或空腹血糖較高等前驅(qū)糖尿病特征［2］。糖尿病使患中風(fēng)的風(fēng)險增加了數(shù)倍，而且糖尿病合并腦卒中的患者預(yù)后較差［3］。糖尿病并發(fā)腦卒中后1周的死亡率明顯增加，并發(fā)1～3個月后的幸存者常遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙和殘疾［4］。

小檗堿（berberine，BE）是從毛茛科黃連屬根狀莖中提取的一種異喹啉生物堿，以往研究表明其對腦缺血有保護作用。但小檗堿對糖尿病合并腦卒中的作用及機制尚不清楚。本研究首先采用高糖高脂飲食及小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病模型，待鑒定成模后，進一步采用右側(cè)大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）致腦缺血再灌注損傷模型。通過神經(jīng)功能缺損評分、腦含水量測定、神經(jīng)元計數(shù)等指標(biāo)評價模型成功與否及病變損傷程度，探討小檗堿對2型糖尿病大鼠局部腦缺血組織中水通道蛋白（aquaporin 4，AQP4）表達的影響及其腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠隨機分為糖尿病假手術(shù)組（sham，n=15）、糖尿病腦缺血組模型組（MCAO組，n=15）、假性治療組（DMSO組，n=15）、BE治療組（n=15）。治療組在術(shù)前48 h、24 h，術(shù)后6 h腹腔注射相應(yīng)計量藥物。

1.2 藥品、試劑及儀器

純度＞99%的氯化小檗堿（Sigma公司）用蒸餾水配制成0.5%的水溶液。兔抗大鼠AQP4多克隆抗體（Santa Cruz公司）。儀器：冰凍切片機（Leica CM3050 S），顯微攝像系統(tǒng)（Olympus BX51-DP70）。1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠線栓法缺血再灌注模型（MCAO）的制作：高糖高脂飲食喂養(yǎng)雄性健康SD大鼠4周，禁食12 h后，按30 mg/kg的劑量腹腔注射2%的STZ溶液（0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配置，pH4.5），72 h后，尾靜脈采血測血糖，若隨機血糖高于16.7 mmol/ L，可以確定大鼠2型糖尿病模型造模成功，大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)至實驗12周。選取連續(xù)飼養(yǎng)12周模型成功糖尿病大鼠，采用線栓法制備局灶性腦缺血模型。大鼠禁食12 h，采用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射以麻醉大鼠，然后將大鼠仰臥位固定，頸部右側(cè)切口，逐層依次分離并暴露右頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，用動脈夾夾閉右頸總動脈和頸內(nèi)動脈。在距頸總動脈分叉8～10 mm處結(jié)扎并剪斷右側(cè)頸外動脈后，下拉其近心端，使其與右側(cè)頸內(nèi)動脈呈1直線。然后在分叉附近剪一V形口，將直徑0.23 mm線栓向頸內(nèi)動脈插入，當(dāng)線栓插入距頸總動脈分叉18～20 mm處并遇到輕微阻力時，表明線栓已插至Willie′s環(huán)大腦前動脈起始處，此為右側(cè)大腦中動脈缺血模型。留置線栓1 h后將其拔除，再灌注時間為24 h。假手術(shù)組大鼠進行同樣術(shù)式，但不插入線栓。

1.3.2 神經(jīng)功能缺失評分：大鼠蘇醒后，采用5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，采用單盲法進行神經(jīng)功能評分。0分為正常，無神經(jīng)功能缺損；1分為右側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分為行走時，大鼠向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分為行走時，大鼠身體向右側(cè)傾倒，中度神經(jīng)功能缺損；4分為不能自發(fā)行走，有意識喪失。選擇1～3分的大鼠計入實驗，去除不符合實驗條件及死亡的大鼠，并嚴(yán)格按照實驗條件進行補充。

1.3.3 Nissl染色：4%多聚甲醛灌注大鼠，然后取出完整鼠腦，使用4%多聚甲醛后固定，過夜后蔗糖脫水，把脫水后的鼠腦在冰凍切片機內(nèi)用OCT包埋，冰凍切片厚度為20 μm，然后貼片。Nissl染色步驟如下：把晾干的切片放入純水中10 s，焦油固紫工作液中1 h，避光，再放入純水中數(shù)秒，洗去浮色，依次浸入70%、80%、95%的乙醇中數(shù)秒，以不掉色為好，然后將切片放入特殊分色液中（1∶1∶1無水乙醇，氯仿，乙醚）數(shù)秒后，將切片浸入100%乙醇5 min×2次，最后浸入二甲苯5 min×2次，用樹膠透明封固，在顯微鏡下觀察。

1.3.4 腦含水量測定：干濕重法測定缺血側(cè)腦水腫。大鼠麻醉后快速斷頭取腦，沿腦中線切取缺血側(cè)大腦半球稱濕重，然后將其置于110℃烤箱中烘烤24 h，取出稱干重，腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以表示。檢驗方法為多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BE對缺血性腦卒中糖尿病大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變的影響

MCAO后再灌24 h對糖尿病大鼠的神經(jīng)行為表現(xiàn)進行觀察，發(fā)現(xiàn)sham組糖尿病大鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)基本正常。MCAO致糖尿病大鼠局灶性缺血后，糖尿病大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，具體表現(xiàn)為活動減少、側(cè)傾、轉(zhuǎn)圈、低反應(yīng)性、前肢屈曲和運動失調(diào)等。預(yù)先給予BE可明顯改善這些行為學(xué)改變（P＜0.05，圖1）。

2.2 BE對缺血性腦卒中糖尿病大鼠腦組織神經(jīng)細胞丟失的影響

我們利用Nissl方法檢測了糖尿病大鼠皮層缺血神經(jīng)細胞的缺失情況。MCAO 1 h后再灌24 h，MCAO組糖尿病大鼠皮層有一定程度的神經(jīng)細胞丟失，預(yù)先給予BE，神經(jīng)細胞丟失明顯的得到改善（P＜0.05，圖2）。

圖1 大鼠神經(jīng)功能評分Fig.1 The neurological deficit scores of rats

2.3 BE對缺血性卒中糖尿病大鼠腦組織水腫的影響

sham組、模型組與BE治療組缺血側(cè)腦組織干濕重比值分別為67%、86%、71%。與sham組相比，模型組大鼠腦缺血再灌注損傷后干濕重比值明顯增加，而BE治療組較模型組干濕重比值明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 Nissl染色檢測神經(jīng)細胞丟失情況 ×200Fig.2 Nissl staining and the changes of neuronal loss×200

圖3 BE治療后腦組織水腫程度的變化統(tǒng)計圖Fig.3 Changes of brain edema after BE treatment

2.4 BE對缺血性腦卒中糖尿病大鼠腦組織中AQP4表達的影響

蛋白印跡檢測結(jié)果顯示：與sham組相比，在MCAO處理后AQP4表達水平都升高，但與MCAO組相比，預(yù)先給予BE，使缺血再灌致小鼠腦內(nèi)中AQP4水平明顯降低（P＜0.05，圖4）。

3 討論

本研究利用2型糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，神經(jīng)細胞缺失嚴(yán)重，腦水腫明顯，缺血半影區(qū)腦組織AQP4表達上調(diào)。給予BE治療后，明顯改善大鼠缺血損傷后神經(jīng)功能，減少神經(jīng)細胞缺失，減輕腦水腫，同時，缺血半影區(qū)腦組織AQP4表達下調(diào)。

圖4 小檗堿對大鼠腦組織中AQP4表達的影響Fig.4 Changes of AQP4 expression levels after BE treatment

研究資料表明，糖尿病是嚴(yán)重威脅人們健康的主要疾病之一，患者的死亡原因主要是各種并發(fā)癥的出現(xiàn)，其中腦卒中是糖尿病重要的并發(fā)癥及死亡原因之一。糖尿病患者的腦卒中發(fā)生率是非糖尿病患者的數(shù)倍，并且糖尿病患者在腦卒中后的病死率較非糖尿病患者明顯升高。在發(fā)病年齡上，與非糖尿病人群相比，糖尿病所致腦卒中發(fā)病年齡較輕，可提前10～20年。因此，糖尿病并發(fā)腦卒中受到國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注。BE具有廣泛的臨床應(yīng)用，可用于治療糖尿病、心律失常、細菌性痢疾、充血性心力衰竭、皮膚病、高血壓、胃及十二指腸潰瘍及抗血栓等。以往研究發(fā)現(xiàn)BE具有一定的腦缺血損傷保護作用，但其機制尚不十分清楚［5］。

AQP是一種位于細胞膜上的蛋白質(zhì)（內(nèi)在膜蛋白），由約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的美國科學(xué)家彼得·阿格雷所發(fā)現(xiàn)，在細胞膜上組成“孔道”，作用是控制水在細胞的進出。水分子進入彎曲狹窄的通道內(nèi)，會形成單一縱列，內(nèi)部的偶極力和極性能夠幫助水分子旋轉(zhuǎn)，以適當(dāng)?shù)慕嵌却┻^狹窄的通道。研究表明，AQP主要有2種調(diào)節(jié)方式，即短時調(diào)控和長時調(diào)控，并且在調(diào)節(jié)過程中，會受到一些細胞因子等因素的影響。AQP的短時調(diào)控相對比較迅速，是通過改變AQP對分子的選擇及通透性而發(fā)揮作用。長時調(diào)節(jié)是一種慢性的調(diào)節(jié)方式，主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，與cAMP途徑關(guān)系密切。AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道蛋白，在腦組織水平衡的調(diào)節(jié)中起到非常關(guān)鍵的作用。研究表明，AQP4在腦組織的高表達與神經(jīng)細胞毒性腦水腫程度呈正相關(guān)，并且抑制星形膠質(zhì)細胞AQP4的表達可以減輕腦水腫的程度。所以，腦缺血損傷中下調(diào)AQP4可以減少水分子內(nèi)流，利于減輕缺血后腦水腫。

本研究采用2型糖尿病大鼠MCAO后24 h再灌腦缺血模型，使用神經(jīng)功能學(xué)評分和尼氏染色方法檢測BE對2型糖尿病大鼠缺血性腦損傷的影響。使用Western blot方法檢測BE對腦組織AQP4表達的影響。結(jié)果顯示，預(yù)先給予BE，神經(jīng)功能得到明顯改善，神經(jīng)細胞丟失明顯減少，并使缺血再灌致小鼠腦內(nèi)中AQP4表達水平明顯降低，從而減輕腦水腫，降低死亡率，這可能是其抗腦缺血作用的機制之一。

［1］Ergul A，Elgebaly MM，Middlemore ML，et al.Increased hemorrhagic transformation and altered infarct size and localization after experimental stroke in a rat model type 2 diabetes［J］.BMC Neurol，2007，15（7）：33.

［2］Luitse MJ，Biessels GJ，Rutten GE，et al.Diabetes，hyperglycaemia，and acute ischaemic stroke［J］.Lancet Neurol，2012，3（11）：261-271.

［3］Knoflach M，Matosevic B，Rucker M，et al.Functional recovery after ischemic stroke-a matter of age：data from the Austrian Stroke Unit Registry［J］.Neurology，2012，78：279-285.

［4］Ergul A，Kelly-Cobbs A，Abdalla M，et a1.Cerebrovascular complications of diabetes：focus on stroke［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2012，12（2）：148-158.

［5］Yoo KY，Hwang IK，Lim Bo，et a1.Berberry ectract reduces neuronal damage and N-Methy-D-aspartate receptor 1 immunore activity in the gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia［J］.Biol Pharrn Bull，2006，29（4）：623-628.

（編輯 裘孝琦）

Effect of Berberine on AQP4 Expression in Focal Cerebral Ischemia Area in Diabetic Rats

CUIHong-yu1，LIANGXin-yu2，LUYi-jun2，WANG Peng2，LIU Xue-zheng1

（1.Department of Human Anatomy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Department of Neurobiology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of berberine on the expression of AQP4 and neuronal injury after focal cerebral ischemia in diabetic rats.MethodsMale SD rats were randomly divided into four groups：control（sham surgery），middle cerebral artery occlusion and reperfusion（MCAO/R），MCAO/R treated with vehicle（DMSO），MCAO/R treated with berberine.The transient focal ischemia/reperfusion was induced by introducing silicone-coated monofilament nylon suture from the right external carotid artery into the origin of the middle cerebral artery，which was removed after60 min.In group treated with berberine，the rats were injected with berberine before and after suffered from cerebral ischemia.Similarly，in group vehicle，the animals received DMSO vehicle at the same time.The score of neurological behavior was evaluated 24 h after reperfusion.Meanwhile，the rats were sacrificed for Nissl staining.To estimate cerebral edema，the wet-dry ratio was measured.The expression of AQP4 in the border of the infarct region in different groups was observed by Western blot.ResultsCompared with the model group，berberine improved neurological deficits（P＜0.05）.Berberine treatment inhibited the neuronal deformation shown by Nissl staining（P＜0.05）.Berberine significantly decreased the wet-dry ratio and reduced the expression of AQP4（P＜0.05）.ConclusionThese results suggested that berberine could induce neuroprotection against ischemic injury by inhibiting the expression of AQP4 in diabetic rats.

berberine；cerebral ischemia；type 2 diabetes mellitus；AQP4

R322.8

A

0258-4646（2015）12-1102-04

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目

崔洪雨（1973-），男，助理研究員，博士研究生.

劉學(xué)政，E-mail：liuxuezheng168@vip.sina.com

2015-09-22

網(wǎng)絡(luò)出版時間：