舟形藻在假單胞菌菌膜上的附著及對316L不銹鋼腐蝕的影響

管 方，翟曉凡，段繼周，張 杰，侯保榮

（1.中國科學院海洋研究所 海洋環境腐蝕與生物污損重點實驗室，青島266071；2.中國科學院大學，北京100049）

海洋生物污損是伴隨著人類的海洋開發活動而對人造海洋設施產生的一類生態危害，例如造成管線堵塞，船舶航行阻力增加，海洋平臺載荷增加，并可能增加腐蝕風險，生物污損會造成巨大經濟損失［1］。附著于材料表面的微生物膜是誘導生物污損進一步發展的重要原因，它也是材料腐蝕發生的重要因素［2］。鋼鐵構筑物等設施浸入海水環境后其表面幾分鐘內便形成一層富含有機質的調控膜，隨后細菌、硅藻等微生物相繼附著進而形成生物膜［3-5］，影響這一過程的因素包括材料表面形貌［6］、表面電荷［7］和表面潤濕度［8］等。細菌膜作為生物膜的重要組成之一，其形態和結構很大程度上決定了后續大型生物的附著，并影響整個生物污損過程。已有研究表明，菌膜既可以促進也能抑制其他微生物的附著［9-10］。Gawne等［11］研究了細菌對硅藻附著的影響，發現硅藻的附著隨基體材料的表面電荷和材料質地不同而不同，菌膜可以通過分泌多聚糖來改變基體材料的表面電荷和質地從而影響硅藻的附著。Joint等［12］在研究浮游孢子在菌膜的附著時也得到了相似的結論。

海洋微藻是重要的污損生物之一，其在水下基體的附著是誘發其他污損生物附著的重要因素，并影響隨后污損生物群落的發展。舟形藻屬（Navicula）隸屬于硅藻門，在金屬表面的附著是一個逐級有序的過程，包括到達表面后著陸、初始附著、滑行及永久附著四個步驟［13］。舟形藻通過初期附著選擇最優的生存環境，初期附著可以是暫時的也可以是永久的［14］。進入新環境后，處于懸浮狀態的舟形藻細胞在重力、水流作用下到達固體表面，通過與固體表面的靜電引力或與附著在固體表面有機質間的相互作用同固體表面結合。此外，菌膜的形成是海洋生物污損過程中一種常見的現象，然而海洋微藻在細菌膜上的附著規律及其對金屬腐蝕的影響尚未得到足夠的重視。因此，本工作采用銅綠假單胞菌（Pseudomons aeruginosa PAO1）形成菌膜，對比舟形藻在無菌膜的不銹鋼試片表面的附著力及電化學腐蝕行為，就菌膜對舟形藻附著的影響及其對316L不銹鋼腐蝕的影響進行了初步研究。

1 試驗

1.1 試樣

試驗采用316L不銹鋼試片，其化學成分（質量分數／%）為：C 0.022，Mn 0.97，P 0.028，Si 0.69，S 0.003，Ni 10.03，Cr 6.28，Mo 2.16，N 0.015，余量為鐵。試驗采用2種典型的污損微生物：銅綠假單胞 菌（Pseudomons aeruginosa PAO1）和 舟 形 藻（Navicula）。

試樣尺寸為10mm×10mm×2mm，試驗前試片用水砂紙逐級打磨至2000號，最后用0.3μm的Al2O3拋光粉拋光，無水乙醇擦洗，放入無水乙醇中超聲清洗10min。取出晾干，在紫外照射條件下30min滅菌。

1.2 細菌培養與生長曲線測定

配制LB培養基（10.0g·L-1NaCl；10.0g·L-1胰蛋白胨；5.0g·L-1酵母提取物），調節pH至7.0，121℃滅菌30min，接種銅綠假單胞菌（P.aeruginosa PAO1）微生物菌株，置于37℃的振蕩培養箱中過夜培養22h，取60μL于200mL LB培養液作為試驗中用到的培養基，綠銅假單胞菌濃度大約104個／mL。

在盛有200mL LB培養基的250mL廣口瓶中接種菌株銅綠假單胞菌使初始濃度為104個／mL。在33℃中培養，用平板計數法連續13d進行細菌計數，得到生長曲線。

1.3 舟形藻生長周期

在盛有200mL f／2培 養 液（NaNO37.48×10-2g·L-1；NaH2PO44.4×10-3g·L-1；Na2SiO3·9H2O 8.4×10-3～16.7×10-3g·L-1；ZnSO4·4H2O 2.3×10-5g·L-1；MnCl2·4H2O 1.78×10-4g·L-1；CuSO4·5H2O 1.0×10-5g·L-1；FeC6H5O7·5H2O 3.9×10-6g·L-1；Na2MoO4·2H2O 7.3×10-6g·L-1；CoCl26·H2O 1.2×10-5g·L-1；Na2EDTA 4.35×10-6g·L-1；維生素B12 5×10-8g·L-1；維生素B1 1×10-4g·L-1；維生素H 5×10-8g·L-1）的250mL廣口瓶中接種舟形藻，使體系中舟形藻的初始濃度為130個／mL，在體系中懸掛20mm×20mm×2mm載用玻璃試片，每天取出在血小板計數器上于顯微鏡下計數，計算單位面積上的舟形藻數目。

1.4 原子力顯微鏡（AFM）附著力試驗

將經打磨拋光的316L試片放入P.aeruginosa PAO1濃度為104個／mL的菌液中培養，分別于不同采樣時間（1d、4d、11d）取出試片，100mmol／L PBS（磷酸緩沖液）沖洗三次以除去未粘附細胞，用原子力顯微鏡（日本精工，SPA400）觀察。

將上述在菌液中浸沒處理過的試片放在舟形藻溶液中培養，分別于不同時間（1d、10d）取出試片，用原子力顯微鏡觀察。潔凈的試片在舟形藻溶液中培養，分別于不同采樣時間（1d、10d）取出試片，用原子力顯微鏡觀察。

1.5 電化學試驗

試驗所用電極為316L不銹鋼電極，尺寸為10mm×10mm×2mm，長約15cm的銅導線連接，用環氧樹脂將電極密封，只保留10mm×10mm的工作面。將制作好的316L不銹鋼工作電極用水砂紙逐級打磨至2000號，無水乙醇沖洗，放入無水乙醇中超聲清洗10min。

電化學試驗采用三電極體系，316L不銹鋼電極為工作電極，2mm×2mm鉑電極作為對電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極。文中電位若無特指，均相對于SCE。電化學阻抗譜掃描頻率范圍為10mHz～100kHz，電壓振幅為10mV。應用ZSimpWin Version3.21電化學分析軟件對試驗結果進行分析。

2 結果與討論

2.1 銅綠假單胞菌（Pseudomons aeruginosa PAO1）的生長周期

銅綠假單胞菌（P.aeruginosa PAO1）的生長曲線見圖1。可以看出，P.aeruginosa PAO1在5h后即進入對數生長期，該期間細菌以二次分裂的方式快速繁殖，菌含量最高達1010～1011個／mL。48h后隨著培養基中營養物質的減少和代謝廢物的增多，環境不再利于細菌的生長，死亡的細菌個數超過新生的細菌個數，細菌總數開始下降。

圖1 銅綠假單胞菌PAO1的生長曲線Fig.1 The growth curve of Pseudomons aeruginosa PAO1

2.2 舟形藻生長周期

由圖2可以看出，約5d后，舟形藻在試片表面附著，開始呈指數生長。隨著環境中營養物質的消耗和代謝廢物的增多，舟形藻的附著量減少，同時脫附量漸漸增多，最終達到一個動態平衡。

圖2 舟形藻生長曲線Fig.2 The growth curve of Navicula

2.3 銅綠假單胞菌在316L不銹鋼表面的附著力的變化過程

原子力顯微鏡觀察附著力試驗結果表明，不同時間內P.aeruginosa PAO1菌株在316L不銹鋼表面的附著力不同。由表1可見，附著力先增大后減小，最后又增大到最大值。這可能與P.aeruginosa PAO1的活性變化及其分泌物有關，結合P.aeruginosa PAO1的生長周期可以看出，在24h內細菌處于對數增長期，繁殖迅速，細菌在試片表面附著形成菌落，故而在四種試片表面第一天時的附著力相對于其空白試樣附著力都會增加，這表明了P.aeruginosa PAO1在試片表面的有效附著。隨后，細菌活性下降，對試片表面的附著減弱。但是在11d的AFM附著力增大到最大值，說明PAO1細菌在316L不銹鋼表面已經形成穩定的生物膜。

表1 PAO1細菌在1，4，11d時在不銹鋼試片表面的附著力（nN）Tab.1 The adhesion force（nN）of PAO1on 316Lstainless steel after 1d，4d，11d

鑒于細菌在316L不銹鋼表面的附著力在11d達到最大，且已經形成穩定的生物膜，因此選擇菌膜形成11d時的試樣與無菌膜的試樣作對比，進行舟形藻在試片表面的附著試驗，試驗結果見表2。

表2 舟形藻在316L表面的平均附著力Tab.2 The average adhesive force of Navicula on 316Lstainless steel

由表2可知，浸泡初期（1d），有菌膜不銹鋼表面的附著力低于在無菌膜不銹鋼，且顯著低于未浸入藻液時，這可能是因為菌膜表面物質與舟形藻間的相互作用或進入新環境后菌膜的脫落造成了附著力的降低。而浸泡后期（10d），有菌膜不銹鋼表面的附著力顯著高于無菌膜不銹鋼，相較于初始狀態也有一定升高，可見PAO1菌膜的存在顯著促進了舟形藻的附著。

2.4 微生物附著的電化學分析結果

2.4.1 開路電位

如圖3所示，無藻無菌膜和有藻無菌膜體系的開路電位初始值一致且明顯正于有藻有菌膜的體系。試驗期間，無藻無菌體系的開路電位基本穩定，僅在初始浸泡階段有很小的波動，初始浸泡階段2d內，開路電位發生了正移，由浸泡前的-0.228 75V升高到-0.180 67V，正移了48.08mV，可能是由于不銹鋼表面鈍化膜的形成造成的。隨后（浸泡2～6d），電極的開路電位又逐漸負移，第6天電極的開路電位達到-0.308 78V，負移128.11mV，最后開路電位穩定在-0.31V附近。

圖3 不同條件存在下的開路電位值Fig.3 The open circuit potential of 316LSS under different conditions

有藻無菌膜體系的開路電位呈現出較大的波動，光滑的316L不銹鋼電極在有舟形藻溶液的開路電位明顯比其在無舟形藻溶液中時更正，說明316L不銹鋼在舟形藻溶液中有更大的腐蝕傾向。在有藻有菌膜的體系中，由于菌膜-硅藻-電極間復雜的相互作用［15］，使得開路電位極不穩定。在有舟形藻的體系中，無論電極表面形成菌膜與否，其開路電位變化趨勢一致（如圖3所示）：在剛浸沒入培養液一周內，舟形藻的新陳代謝處于增長期，在電極表面的大量附著使316L不銹鋼電極開路電位處于波動狀態；一周后舟形藻的新陳代謝最高峰結束，舟形藻對電極開路電位的影響減弱，開路電位趨于穩定。

可以看出，不同體系中316L不銹鋼電極的開路電位變化不同，但在浸泡大約5～8d后都趨于穩定。穩定后，各體系間開路電位大小關系為無藻無菌膜體系＞有藻有菌膜體系＞有藻無菌膜體系。這說明，舟形藻的存在會增加316L不銹鋼的腐蝕敏感性，菌膜的形成則一定程度上降低了316L不銹鋼在舟形藻Navicula溶液中的腐蝕敏感性。

2.4.2 電化學阻抗譜

圖4為光滑的316L不銹鋼在f／2培養液中不同條件下的Nyquist圖。在無藻無菌膜、有藻無菌膜和有藻有菌膜三個體系中，316L不銹鋼的容抗弧半徑在經歷了5～7d的迅速增大后趨于穩定。這與其開路電位5～8d后趨于穩定的變化特點相吻合。

圖4 光滑的316L在無舟形藻的f／2培養液中不同條件下的電化學阻抗譜Fig.4 EIS of 316LSS immersed in f／2in different conditions for different times（a） without navicula and biofilm （b） with navicula but no biofilm （c） with navicula and biofilm

圖5 為316L不銹鋼在f／2培養液中不同條件下的電化學阻抗譜等效電路擬合。圖中，Rs表示溶液電阻，Cp表示腐蝕產物膜電容，Rp表示腐蝕產物膜電阻，Cdl表示界面雙電層電容，Rct表示電荷傳遞電阻。相關電化學參數擬合結果見表3～表5。

由表3可知，在無藻無菌膜體系，對電阻起決定作用的是電荷傳遞電阻。在有藻有菌膜和有藻無菌膜體系中，出現了膜電阻。在剛開始浸泡1～2d內，有藻有菌膜的膜電阻遠遠大于有藻無菌膜的膜電阻，這是因為在有藻有菌膜體系的電極表面附著有穩定的菌膜。隨后，有藻有菌膜體系中的伴隨著菌膜的脫落，而舟形藻尚未大量附著造成膜電阻的迅速降低。有藻無菌膜體系中由于舟形藻在電極表面的大量附著，膜電阻迅速增大并趨于穩定。一周后有藻有菌膜體系中，舟形藻的大量附著使其膜電阻增大并趨于穩定。這時兩個體系中的膜電阻基本相同。10～11d時，由于培養液中營養物質的消耗，附著的微藻開始大量脫落，膜電阻都急劇下降。這與AFM結果是相一致的。

2.4.3 動電位極化曲線

圖6為不同條件下的316L不銹鋼在f／2培養液中的動電位極化曲線。可以看出，316L不銹鋼在含舟形藻培養液中的極化曲線陽極區斜率發生了明顯變化，說明舟形藻的存在改變了陽極表面的腐蝕過程。表6為三種體系的動電位極化參數。

圖5 316L不銹鋼在f／2培養液中不同條件下的Nyquist圖的等效電路擬合Fig.5 Equivalent circuit to model the Nyquist patterns of 316LSS immersed in f／2in different conditions for different times（a） without navicula and biofilm（b） with navicula but no biofilm（c） with navicula and biofilm

表3 無藻無菌膜體系的模擬電路的數據R｛C［R（CR）］｝Tab.3 Electrochemical parameters of 316LSS without biofilm and Navicula

由表6可見，在無藻無菌膜體系下隨著時間的增長，腐蝕電位Ecorr逐漸減小，腐蝕電流密度Jcorr先增大后減小；在有藻無菌膜體系下隨著時間增長，腐蝕電位Ecorr逐漸減小；腐蝕電流密度Jcorr逐漸增大。相較于無藻無菌膜體系，浸泡時間相同時，Ecorr更負，Jcorr更大。說明舟形藻存在，促進了316LSS在f／2培養液中的腐蝕。

表4 有藻無菌膜體系的模擬電路的數據R（CR）（CR）Tab.4 Electrochemical parameters of 316LSS with Navicula but no biofilm

表5 有藻有菌膜體系的模擬電路的數據R［C｛R（CR）｝］Tab.5 Electrochemical parameters of 316LSS with Navicula and biofilm

與前兩個體系不同，在有藻有菌膜體系下隨著浸泡時間增加，Ecorr和Jcorr都呈現出較大的波動，且Ecorr越負，相應的Jcorr越大。試驗后期，該體系的Jcorr小于有藻無菌膜體系，表明菌膜的存在，一定程度上抑制了舟形藻對316L不銹鋼的腐蝕。

3 結論

（1）原子力顯微鏡的附著力試驗結果表明，菌膜的存在促進了舟形藻的附著。舟形藻在固體表面的附著與其生長周期呈現出一致性，說明舟形藻的附著過程與舟形藻的新陳代謝密切相關。

（2）舟形藻的存在增加了316L不銹鋼的腐蝕傾向，而菌膜的存在一定程度上抑制了舟形藻對316L不銹鋼的腐蝕。

圖6 不同菌膜體系下的動電位極化曲線Fig.6 Polarization curves of the 316LSS immersed in f／2culture solutionsc（a） without navicula and biofilm （b） with navicula but no biofilm （c） with navicula and biofilm

表6 不同菌膜條件下316L不銹鋼在f／2培養液中的動電位極化參數Tab.6 Fitting results of polarization curves for 316LSS in f／2culture solution under different conditions

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