疏風宣肺方與解表清里方對流感病毒H1N1感染的A549細胞凋亡的影響*

葛世杰，劉曉婷 ，張 沂 ，盧娜娜，顧立剛△，吳 珺，邱澤計，張洪春，晁恩祥

1北京中醫藥大學基礎醫學院中醫藥抗病毒重點實驗室，北京 100029；2北京中日友好醫院

在流感病毒感染細胞時，病毒自身蛋白以及細胞分泌的信號分子均參與這一過程，如Fas-FasL腫瘤壞死因子(TNF)、天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白(Caspase)、轉化生長因子(TGF)、有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶等，盡管許多蛋白質被證明與流感病毒的凋亡有關，但尚缺乏進一步的機制探討［1］。目前對中醫藥拮抗甲型H1N1流感病毒誘導的細胞凋亡作用鮮有報道，本研究旨在探討疏風宣肺方和解表清里方對人肺癌細胞株A549的作用及其機制，為進一步闡明兩種不同治法方藥對流感的作用機制提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺腺癌上皮細胞(A549)購自中國醫學科學院細胞中心；McCoy's 5A培養基和胎牛血清(gibco公司，美國)；0.25%胰酶-0.02%EDTA(Thermo公司，美國))；細胞培養液(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素混合物的完全McCoy′s 5A培養基)；細胞維持液 (含2.0%胎牛血清的McCoy′s 5A培養基)；1.5%雞紅細胞混懸液；PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成）；M-MLV反轉錄試劑盒 (TaKaRa公司)；qRT-PCR擴增試劑盒 (北京澤平生物技術有限公司)；100 bp DNA ladder(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2 流感病毒 甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株（由中國中醫科學院中藥所為本研究長期低溫保存備用）；九日齡雞胚尿囊腔連續傳代2次后，病毒原液血凝滴度為1:128，TCID50=10-3.778。

1.3 實驗藥物 疏風宣肺方由金銀花、連翹、牛蒡子、蟬蛻、荊芥等組成，并制備成顆粒劑；解表清里方由炙麻黃、生石膏、黃芩、杏仁、生甘草等組成，并制備成顆粒劑，顆粒劑由中日友好醫院藥廠制備；陽性對照藥物磷酸奧司他韋膠囊(達菲)由瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏公司生產，批號：B1354，分裝批號：SH0037。

1.4 細胞培養 將A549細胞加細胞培養液經3～4次傳代后，細胞恢復正常生長周期。將生長狀態良好的細胞加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化細胞，洗脫后加入細胞培養液調整細胞濃度為1.5×105/mL接種于60mm培養皿中，在37℃，5%CO2培養箱中常規培養24小時后，使得細胞呈單層貼于孔底。取增殖旺盛、狀態良好的細胞用于實驗。

1.5 分組 本研究分為細胞對照組，H1N1感染組，奧司他韋對照組0.75μg/mL，疏風宣肺組2.5μg/mL，解表清里組2.5μg/mL。除細胞對照組外，均使用流感病毒H1N1吸附2小時后，棄掉病毒液，PBS清洗2次后，加入上述濃度的藥物，作用24h后棄去上清，PBS清洗1次后，加入細胞裂解液，置-80℃冷凍過夜。

1.6 基因芯片分析 芯片實驗由華聯生物科技股份有限公司完成，包括3次生物學重復。在樣本中提取各組細胞總mRNA后，在收集的樣本中提取細胞總RNA，定量并鑒定其完整性，保證無降解。RNA首先被反轉錄合成cDNA，用熒光染料Cy3和Cys雙色熒光標記，檢定熒光強度和標記效率，進行芯片雜交及掃描，實驗重復3次，計算探針信號在各組與模型組的強度比值。查找基因信息功能及生物路徑，篩選出與凋亡相關通路中密切相關的差異表達基因。各組探針訊號的強度比值，以log2(Ratio)表示。與H1N1感染組比較，log2(Ratio)＞1，表示顯著上調的表達基因；log2(Ratio)＜-1，表示顯著下調的表達基因。

1.7 熒光定量PCR檢測 設計引物序列：內參GAPDH(136 bp)：上游 5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′，下游 5′-GACTGTGGTCATGAGTCCT-3′；Caspase-3(131bp)：上游 5′-AGCACTGGAATGACATCTCG-3′，下 游 5′-CGCATCAATTCCACAATTTC-3′；Caspase-8(97bp)：上游 5′-TGCAAGAGGAAATCTCCAAA-3′，下游5′-TTTCCTTCTCCCAGGATGAC-3′；Caspase-9(99bp)：上游 5′-CTCAGACCAGAGATTCGCAA-3′，下游 5′-CTCA AGAGCACCGACATCAC-3′；Fas(93bp)：上游 5′-GAAC ACTGTGACCCTTGCAC-3′，下游 5′-TCTGGATCCTTCCTC TTTGC-3′；FasL(67bp)：上游 5′-AGAAGGAGCTGGCAG AACTC-3′，下游 5′-TGCTTCTCCAAAGATGATGC-3′。提取各組細胞總mRNA后，進行反轉錄。按試劑盒說明，進行PCR反應。RT-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外自動成像系統，啟動自動分析軟件，記錄目的基因擴增條帶的灰度值，并分別計算內參基因GAPDH值與各樣本目的基因的比值，統計目的基因表達的相對量，采用2-ΔΔCT方法計算。

1.8 Western blot ting法檢測相關蛋白表達收集細胞提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干電轉膜儀轉膜。封閉后加入 FAS、FAS-L一抗，4℃過夜。洗膜3次，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，振蕩。將PVDF膜于室溫下振蕩溫育。ECL顯色，X線膠片曝光，經顯影、定影、掃描后觀察結果。應用Image-Pro Plus軟件對掃描圖像的目的條帶進行吸光度分析，各目的條帶與GAPDH的吸光度比值為目的蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法 數據采用SPSS 17.0統計軟件進行處理，計量資料以(χ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 基因芯片數據分析生物學路徑及部分經典差異表達基因 通過KEGG pathway分析涉及細胞凋亡信號傳導途徑。與細胞對照組相比，H1N1感染組差異表達基因 Casp3、Casp8、Casp9及 Fas、FasL明顯上調，奧司他韋組、疏風宣肺組和解表清里組對差異表達基因 Casp8、Casp7、Fas、FasL明顯下調，見表1。

2.2 疏風宣肺方和解表清里方對甲型流感病毒H1N1感染的 A549 細胞中 Caspase-3、-8、-9 及Fas、FasL的mRNA表達的影響 與細胞對照組比較，H1N1感染組 Caspase-3、-8、-9及 Fas、FasL的 mRNA表達均顯著升高(P＜0.01)；與H1N1感染組比較，疏風宣肺組的 Caspase-3、-8、-9及 Fas、FasL的mRNA表達均明顯降低(P＜0.05)，解表清里組對 Caspase-3、-9及 Fas、FasL的 mRNA表達均明顯降低(P＜0.05)，同時，疏風宣肺組治療效果優于解表清里組，見表2。

表1 甲型流感病毒H1N1感染A549細胞后TLR3/7信號通路中基因轉錄的變化

表2 各組藥物對H1N1感染A549細胞中Caspase-3、-8、-9及Fas、FasL的mRNA轉錄水平的影響(χ±s)

2.3 疏風宣肺方和解表清里方對甲型流感病毒H1N1感染的A549細胞中Fas、FasL的蛋白表達H1N1感染組Fas、FasL蛋白較細胞對照組顯著升高(P＜0.05)；與H1N1感染組比較，兩種方藥的Fas、FasL表達均顯著降低(P＜0.05)，見圖1。

圖1 兩種方藥對甲型流感病毒H1N1感染的A549細胞中Fas、FasL的Western blot蛋白相對表達量

3 討論

流感病毒侵犯呼吸道，因此呼吸道上皮細胞是最適于病毒增殖的靶細胞。但在體外實驗中，病毒在不同細胞系中增殖特點不同，本實驗選用適宜病毒增殖的人肺癌上皮細胞株A549進行研究［2］。

細胞凋亡的發生與A型流感病毒的線粒體蛋白 PB1-F2、NS1蛋白、M2蛋白密切相關。流感病毒感染MDCK細胞、支氣管上皮細胞、肺泡及淋巴細胞，甚至腫瘤細胞，FAS/FAS-L系統是激活靶細胞凋亡最主要的途徑。細胞表面重要的死亡受體FAS，與其配體 FASL結合后活化并傳導凋亡信號，通過線粒體通路和死亡受體通路以誘導細胞凋亡。線粒體途徑和死亡受體途徑中上游的啟動酶分別是Caspase-9和Caspase-8，凋亡下游效應部分的執行蛋白酶是Caspase-3［3］。

本研究發現，甲型H1N1感染A549細胞可誘導Caspase-3、-8、-9及 Fas、FasL mRNA和蛋白大量表達，而疏風宣肺方和解表清里方可顯著抑制甲型 H1N1誘導引起的 Caspase-3、-9及 Fas、FasL mRNA和蛋白表達，具有明顯的抗細胞凋亡作用，且細胞毒性較低。而疏風宣肺方的抗細胞凋亡作用優于解表清里方，印證了臨床研究的平行隨機雙盲安慰劑對照的結果［4］。凋亡的分子機制是涉及多種信號途徑的網絡調控機制，本研究僅探討了2種方藥對凋亡受體途徑FAS/FAS-L系統的影響。還有報道稱，流感病毒利用有活性的NF-κB，介導產生IFN-α/β，促進感染細胞的凋亡，維持病毒自身的生存［5］；流感病毒感染后細胞內IL-6的活性也增強，且其變化趨勢與Fas的轉錄和表達相一致，IL-6很可能是Fas啟動子的調節因子［6］。本研究前期結果表明，疏風宣肺方和解表清里也可能通過調控NF-κB信號通路和抑制IL-6分泌而下調Fas和FasL誘導的細胞凋亡。

疏風宣肺方是在銀翹散基礎上，加減化裁而成。方中主要藥物黃芩、連翹和金銀花對100TCID50甲3型流感病毒所誘導的MDCK晚期細胞凋亡有顯著抑制作用［7］；板藍根凝集素對甲型流感病毒血凝素活性有抑制作用，并通過免疫調節間接抗病毒［8］。解表清里方是在麻杏石甘湯基礎上加減化裁而成，麻杏石甘湯能顯著降低流感病毒感染的MDCK細胞的凋亡百分率，同時，也能通過促進IFN-γ以增強TNF-α等細胞因子對細胞凋亡的誘導效應［9］。兩種方藥中均含有黃芩，具有拮抗甲型流感病毒抑制的細胞增殖，調控細胞周期分布，通過抑制Caspase-8的激活，進一步抑制Caspase-3活性，從而抑制流感病毒感染誘導的細胞凋亡［10］。細胞凋亡涉及眾多基因，網絡狀信號轉導調控模式非常復雜，因此，疏風宣肺方和解表清里方對H1N1感染的細胞凋亡的機制有待深入研究。

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