芪參益氣滴丸預適應內皮細胞對心肌細胞缺氧損傷的延遲保護作用*

馬 妍 ，郭利平

1天津中醫藥大學，天津300193；2天津中醫藥大學保康醫院

近年來研究發現反復短暫的心肌缺血可以使心肌對隨后長時間的缺血再灌注損傷產生明顯的耐受力，即缺血預適應現象(IPC)。IPC的保護作用包括預適應后立即產生持續1～3小時的早期保護作用與預適應后24小時出現持續3～4天的延遲保護作用。研究發現許多中藥對心肌缺血再灌注損傷具有與IPC同等的保護作用［1］。IPC與中藥預適應的作用不僅在動物體內得到證實，在離體實驗研究中，通過應用缺氧預適應細胞模型［2］與缺氧復氧細胞模型分別模擬IPC與缺血再灌注損傷，證實經過缺血預適應或中藥預適應的心肌細胞可對抗缺氧復氧損傷，內皮細胞亦具有相同作用。但是由心肌細胞與內皮細胞共同組成的心臟內環境中，是如何相互作用，中藥預適應在其中會產生怎樣的影響，有待進一步研究。芪參益氣滴丸具有益氣通脈、活血止痛之功效，在冠心病防治方面發揮著重要作用，國家“十五”科技攻關計劃項目“芪參益氣滴丸對心肌梗死二級預防的臨床試驗研究”的初步結果表明。芪參益氣滴丸在心肌梗死的二級預防中顯示出良好的效果［3］。本研究利用transwel l小室建立CMEC與CMC共培養體系，模擬心臟內環境，并且利用芪參益氣滴丸對內皮細胞進行預適應，觀察其對心肌細胞的延遲保護作用，并探討CMEC與CMC的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar乳鼠(3d內)，雌雄不拘［中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK-(軍)2009-003］；胰蛋白酶(Sigma)；Ⅱ型膠原酶(Sigma)；DMEM-F12(Hyclone)；胎牛血清(Bioind)；5-溴脫氧尿嘧啶(Sigma)；0.25%胰酶(Hyclone)；雙抗(青、鏈霉素)；PBS緩沖液(PH7.2～7.4)；芪參益氣滴丸溶液(由天津天士力集團提供中藥浸膏，按一定比例于完全培養基中混合溶解而成）；Transwel l小室(24 wel l，膜孔徑 0.4μm，康寧 3470)；細胞增殖/毒性檢測(CCK-8)試劑盒(同仁化學研究所，日本)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(北京中生生物工程高技術公司)；丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物酶歧化酶(SOD)WST-1法測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；恒溫二氧化碳培養箱(Thermo)；厭氧培養箱(Thermo)；倒置相差光學顯微鏡(Leica)；新穎立式小容量恒溫搖床 (上海世平實驗設備有限公司)；高速冷凍離心機(Beckman)；全自動生化分析儀(日立 7020型，日本)；多功能讀板機(Tecan，瑞士)。

1.2 原代培養 無菌環境下，取乳鼠于75%酒精中浸泡5～6 s后置于培養皿中，開胸暴露心臟，于心臟收縮期剪下心臟放于預冷的PBS緩沖液中(含1%雙抗)，留取心尖，將心尖組織移至錐形瓶瓶口剪碎，加入混合酶5mL(0.1%膠原酶與0.06%胰蛋白酶)于恒溫搖床37℃，轉速110 r/min震蕩5分鐘，第一次消化后棄上清，之后每次消化后需收集上清液，經200目細胞篩過濾至預冷的50mL離心管(提前加入5mL全培)，如此反復消化4-5次至組織成半透明狀時終止；將收集的液體以1 000 r/min、10分鐘離心后棄上清液，加入適量全培重懸細胞沉淀，將混勻的細胞懸液轉入75 cm2培養瓶中，差速培養90分鐘后取出，將培養瓶中細胞懸液倒入加樣槽，加終濃度為0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶，吹勻后繼續移入75 cm2培養瓶中培養，差速培養后75 cm2培養瓶中貼壁細胞為內皮細胞，加入適量全培繼續培養。傳代：將原代心肌培養3天后，鏡下觀察心肌成簇狀或單層，搏動，頻率為80～120次/min，傳代時，棄去培養液，加適量PBS清洗3次，加4mL0.25%胰酶，鏡下觀察1分鐘至細胞大部分收縮，拍打培養瓶底部，細胞脫落后迅速倒入離心管(提前加入5mL全培)，離心 800 r/min，8分鐘，棄上清，以全培重懸細胞，此為第一代細胞。內皮細胞傳代過程與心肌細胞基本相同，本實驗用第一代心肌細胞及穩定生長的第三代內皮細胞進行實驗。

1.3 分組 將心肌細胞分為6組，其中4組嵌套種有內皮細胞的t raswel l小室組成共培養模型，分別為心肌細胞正常組(Cont rol-cm)，心肌細胞損傷組(H/R-cm)，共培養正常組(Cont rol)、共培養損傷組(H/R)、共培養中藥預適應組(QSYQ)、共培養缺氧預適應組(HPC)。

1.4 步驟 將心肌細胞以密度2.5×105個/mL種于24孔板，分6組。將內皮細胞以2×105個/mL種于Transwel l嵌套小室內底面［4］，分4組。48小時后鏡下觀察心肌細胞，24小時后鏡下觀察內皮細胞，細胞狀態良好，同時同步24小時。同步后，各組實驗步驟如下：

1.4.1 Cont rol-cm組 換液，于正常孵箱中培養24小時后，繼續培養28小時(與H/R同步進行，缺氧箱降到O2＜1%約2h)，取上清液待測。

1.4.2 H/R-cm組 換液，于正常孵箱中培養24小時后放入缺氧箱中缺氧24小時，復氧2小時，取上清液待測。

1.4.3 Control組 取未處理的一組內皮細胞，換新鮮培養液并將嵌套小室放入相應心肌細胞孔中，完成共培養體系，于正常孵箱中共培養24小時后，繼續培養28小時，取上清液待測。

1.4.4 H/R組 取未處理的一組內皮細胞，換新鮮培養液并將嵌套小室放入相應心肌細胞孔中，完成共培養體系，于正常孵箱中共培養24小時后，放入缺氧箱中缺氧24小時，復氧2小時，取上清液待測。

1.4.5 QSYQ組 取一組內皮細胞經QSYQ預適應1小時后，將培養液與嵌套小室一同放入相應心肌細胞孔中，完成共培養體系，于正常孵箱中共培養24小時后，放入缺氧箱中缺氧24小時，復氧2小時，取上清液待測。

1.4.6 HPC組 取一組內皮細胞先于缺氧箱中缺氧40分鐘，復氧40分鐘后，將培養液與嵌套小室一同放入相應心肌細胞孔中，完成共培養體系，于正常孵箱中共培養24小時后，再次放入缺氧箱中缺氧24小時，復氧2小時，取上清液待測。

1.5 檢測方法 以CCK-8、SOD評價細胞活力，以LDH、MDA評價細胞損傷程度。

1.6 統計學方法 數據采用SPSS 16.0軟件統計分析，計量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞 CCK-8、SOD、LDH、MDA比較 Cont rol組心肌細胞的細胞活力更好，CCK-8、SOD升高(P＜0.05)；損傷相對減少，LDH下降(P＜0.05)，MDA釋放量無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表 1 心肌細胞 CCK-8、SOD、LDH、MDA比較(χ±s)

2.2 與H/R組比較 H/R-cm組心肌細胞活力更低，CCK-8與SOD均下降，損傷更加嚴重，LDH與MDA均升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；H/R組與Cont rol組比較，細胞處于損傷狀態，達到損傷效果，差異有統計學意義(P＜0.05)；經過QSYQ預適應的內皮細胞與心肌細胞共培養后(QSYQ組)，心肌細胞活力高于H/R組，CCK-8與SOD升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，與Cont rol組相當甚至高于Control組；心肌細胞損傷程度低于H/R組，LDH與MDA升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；經HPC處理的內皮細胞與心肌細胞共培養后(HPC組)，心肌細胞亦表現出對長時間缺氧損傷的耐受力，細胞活力高，損傷程度小；QSYQ組與HPC組細胞活力與損傷程度基本相當，見表1。

3 討論

20世紀80年代后期，研究人員在細胞培養技術的基礎上發展了細胞共培養技術［5］。體外細胞共培養體系的建立，可最大程度地模擬體內環境，進而觀察細胞之間的相互作用。以往研究表明，在心臟的生長發育、收縮活動及各項生理功能中，心臟內皮細胞相關的自分泌、旁分泌因子以及細胞因子都起著十分重要的調控作用［6］。本實驗應用t ranswel l小室建立了心肌細胞(CMC)與心臟微血管內皮細胞(CMEC)的共培養體系，實驗結果表明在正常培養情況下，與CMEC共培養的心肌細胞較單一心肌細胞細胞活力更好，而在經過相同長時間缺氧條件下，與CMEC共培養的心肌細胞表現出損傷程度較小的優勢，說明共培養體系體現了CMEC與CMC的相互作用，而且共培養的細胞環境較單一細胞更接近心臟內環境條件。

在建立了CMC與CMEC共培養體系的基礎上，本實驗初步探索經過中藥預適應的CMEC對心肌細胞的保護作用，實驗結果表明經芪參益氣滴丸預適應的CMEC與經過缺氧預適應的CMEC對心肌細胞長時間缺氧損傷方面表現出了同樣的延遲保護作用。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香油4味藥物組成，主治氣虛血瘀型胸痹心痛，劑型穩定，療效可靠，是已經上市的中成藥，也是體現中醫診治冠心病特色和優勢的代表藥物之一。本實驗僅對CMEC進行芪參益氣滴丸預適應，發現對心肌細胞同樣具有保護作用。基于心肌缺血預適應的作用機制［7］，本研究發現芪參益氣滴丸中的丹參成分主要為脂溶性丹參酮和水溶性丹酚酸兩大類［8］，有研究顯示丹參酮ⅡA能增加內皮細胞NO的分泌［9］，同時缺血預適應是通過NO介導產生對心肌的延遲保護［10-11］。由此可以推測中藥預適應的作用機制可能是CMEC預適應后產生大量內源活性物質分泌到共培養的環境中，這些內源活性物質同NO一樣在某個環節中激發了心肌細胞的預適應系統，從而對心肌細胞產生作用，其作用機制有待進一步研究。

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