白花蛇舌草總黃酮對苯并(a)芘致實(shí)體瘤小鼠IL-2和IL-6的影響*

王秋蘭，朱建坤，韓 濤，林 麗

甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Wild)系茜草科耳草屬植物，帶根全草，別名蛇舌草。味苦、甘,性寒,歸心、肺、肝、大腸經(jīng)。具有清熱解毒、利濕、消腫鎮(zhèn)痛、抗癌功效。近年來,對白花蛇舌草的抗腫瘤作用進(jìn)行了諸多研究，對其抗腫瘤活性成分、作用機(jī)制、臨床使用等各方面的研究都取得了進(jìn)展［1-6］。環(huán)境中有機(jī)物質(zhì)的不完全燃燒可產(chǎn)生大量的多環(huán)芳烴類物質(zhì)(PAH)。PAH在人體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物是二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)，BPDE可以與DNA形成PAH-DNA加合物，引起DNA損傷，誘導(dǎo)基因突變和細(xì)胞癌變，與腫瘤的形成有關(guān)［7-9］。苯并(a)芘是多環(huán)芳烴中最重要的致癌物質(zhì)。PAHs可以引起機(jī)體的免疫抑制反應(yīng)，表現(xiàn)為血清免疫學(xué)指標(biāo)的改變［10］。相關(guān)報(bào)道顯示［11］工人接觸PAHs后有免疫抑制現(xiàn)象，波蘭焦?fàn)t工血清 IgG和IgA明顯降低，而血清lgM和lgE有增高趨勢。IL-2是T細(xì)胞生長因子，能增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性，IL-6由單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，可促進(jìn)B細(xì)胞增生分化和分泌抗體。本研究擬觀察白花蛇舌草總黃酮對IL-2和IL-6的影響，尤其是苯并(a)芘致實(shí)體瘤小鼠IL-2和IL-6的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 白花蛇舌草購于蘭州安寧醫(yī)藥公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室林麗老師鑒定為茜草科耳草屬白花蛇舌草干燥全草。FW200高速中藥粉碎機(jī)(天津華鑫儀器廠)；SKW型數(shù)顯恒溫電熱套(山東鄆城華魯電熱儀器有限公司)；電子天平PL202-L(梅特勒-托利多上海有限公司)；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；40目藥典篩；無水乙醇；苯并(a)芘(美國Accustandard公司產(chǎn)品)；SPF級昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，甘肅中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（甘）2011-0001-0001331；實(shí)驗(yàn)動物器械均購自蘭州市醫(yī)療器械總公司；小鼠IL-2 ELISA檢測試劑盒(96孔)及小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒(96孔)（美國R&D公司）；二甲亞砜、乙醚（上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白花蛇舌草總黃酮的提取 將購買的藥材分撿，去除泥沙雜質(zhì)，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎，過40目藥典篩，然后取一定量的藥材至圓底燒瓶，加10倍量80%乙醇浸泡1小時(shí)后回流提取，待煮沸后至3小時(shí)，抽濾；給藥渣中加6倍量80%乙醇，回流1小時(shí)，抽濾；合并濾液，棄殘?jiān)⒑喜⒑蟮臑V液置蒸發(fā)皿中于水浴蒸發(fā)至無醇味。稱量，計(jì)算得膏率，存于樣品瓶，保存于-80℃超低溫冷藏柜待用。

1.2.2 動物模型制備 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定造模劑量，然后取小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g。分為苯并(a)芘實(shí)驗(yàn)組40只和對照組20只；實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為苯并(a)芘 20mg/kg組、苯并(a)芘10mg/kg組各20只，DMSO溶解苯并(a)芘，配置成4mg/mL溶液，然后以苯并(a)芘 20、10 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射10次；對照組DMSO 100μL/只腹腔注射；2個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)各組均分為白花蛇舌草總黃酮高、低劑量組，每組10只，分別給予白花蛇舌草流浸膏20 g/kg、10 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)給藥2周。

1.3 取材與檢測 給藥結(jié)束，飼養(yǎng)兩周后取材。截止取材時(shí)為止，60只小鼠，存活小鼠共56只，4只小鼠灌胃過程中死亡。乙醚麻醉小鼠，股動脈取血，分離血清，ELISA法測定血清中IL-2及IL-6。解剖小鼠，取肝、脾、腎、胰、胃腸、肺等器官，編號后福爾馬林溶液固定，常規(guī)包埋，切片，HE染色,顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 苯并(a)芘誘發(fā)實(shí)體瘤情況 苯并(a)芘10 mg/kg組19只，發(fā)生肝癌5只，占26.3%；肝細(xì)胞核大深染，核分裂像多見，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，為癌前病變，共14只，占73.7%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；未誘發(fā)胃癌，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞層數(shù)增多，呈現(xiàn)中-重度不典型增生，為癌前病變，共13只，占68.4%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，6只未見明顯病變；未誘發(fā)腎癌，腎小管上皮細(xì)胞混濁腫脹，顆粒變性，結(jié)構(gòu)疏松，部分細(xì)胞異型性明顯，為癌前病變，共9只，占47.4%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，10只未見明顯病變。苯并(a)芘20 mg/kg組發(fā)生肝癌6只，占35.3%，癌前病變11只，占64.7%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；發(fā)生胃癌7只，占41.2%；癌前病變5只，占29.4%，癌及癌前病變與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，5只未見明顯異常；發(fā)生腎癌2只，占11.8%，癌前病變10只，占58.8%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，5只未見明顯異常。苯并(a)芘20mg/kg組的胃癌發(fā)生率明顯高于10mg/kg組，且呈明顯量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組肺臟、胰腺均未見明顯損害。

2.2 IL-2、IL-6檢測

2.2.1 實(shí)驗(yàn)組IL-2、IL-6含量 實(shí)驗(yàn)組IL-2濃度均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；IL-6濃度實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表 1。

表1 IL-2和IL-6含量

2.2.2 白花蛇舌草總黃酮不同劑量組IL-2、IL-6含量 白花蛇草總黃酮低劑量組與高劑量組比較IL-2濃度有明顯差異，且高劑量組明顯高于低劑量組（P＜0.05）；IL-6濃度比較無明顯差異（P＞0.05），見表 2。

表2 白花蛇舌草總黃酮不同劑量組IL-2、IL-6含量

3 討論

多環(huán)芳烴可以對生物體造成多種危害。Heudor f U等［12］在一年的時(shí)間里調(diào)查接觸苯并(a)芘的兒童發(fā)現(xiàn)，15%的兒童肘部患過濕疹，10%的兒童患過風(fēng)疹，20%兒童經(jīng)常打噴嚏、流鼻涕或鼻塞，15%的兒童流過鼻血，25%的兒童感覺呼吸困難，42%的兒童經(jīng)常干咳，60%的兒童易感冒。Troisi GM等［13］研究了由于石油泄漏而產(chǎn)生多環(huán)芳烴污染地域中的海鷗，發(fā)現(xiàn)它們普遍出現(xiàn)體溫下降、脫水、體質(zhì)衰弱等癥狀，而在它們的肝細(xì)胞中檢測到多環(huán)芳烴及其代謝物，證實(shí)其受到多環(huán)芳烴的毒害。Burchiel SW等［10］通過研究發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴可改變?nèi)祟惣?xì)胞中T和B淋巴細(xì)胞的功能并損害單核細(xì)胞。Jedrychoski W等［14］經(jīng)過研究證實(shí)孕婦接觸PAHs可能導(dǎo)致胎兒免疫功能的損害和增加新生兒和幼兒患呼吸道疾病的幾率。Detmar J等［15］的研究表明長期接觸PAHs的孕婦可能導(dǎo)致高流產(chǎn)率。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組IL-2濃度明顯低于對照組，提示苯并(a)芘對機(jī)體的細(xì)胞免疫有明顯的抑制作用。

白花蛇舌草抗腫瘤作用明顯，現(xiàn)有研究已明確了白花蛇舌草一些具有防治腫瘤作用的化學(xué)成分及可能機(jī)制，但還不能準(zhǔn)確地對應(yīng)其可能的物質(zhì)成分，可以確定有多種成分具有抗腫瘤活性。例如脫脂水提醇沉多糖可顯著抑制S-180實(shí)體瘤的生長［16］；多糖可抑制 S-180肉瘤細(xì)胞生長［17］；白花蛇舌草提取物在體外對人肝癌多藥耐藥細(xì)胞Bel-7402有抑制作用［18］；白花蛇舌草乙醇提取物明顯抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞［19］；醇水提取后分成石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位，分別進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)水提部位仍然具有一定的抗腫瘤作用，該部位主要具有白花蛇舌草多糖、寡糖、寡肽、對香豆酸等成分［20］。

白花蛇舌草可刺激小鼠抗體形成細(xì)胞(B細(xì)胞)的產(chǎn)生，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞，使抗體分泌量增加，同時(shí)用藥組小鼠血清IgG含量增加。白花蛇舌草可使ConA激發(fā)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng)，表明白花蛇舌草對T淋巴細(xì)胞功能具有增強(qiáng)作用，已知T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)賴以實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞，在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中起核心作用，因此白花蛇舌草可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

本實(shí)驗(yàn)中，白花蛇舌草總黃酮高劑量組IL-2濃度高于低劑量組；白花蛇舌草總黃酮低劑量組與高劑量組比較IL-6濃度無明顯差異，提示白花蛇舌草總黃酮有一定的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能，可能是通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能發(fā)揮作用，而對B細(xì)胞功能及體液免疫的影響不顯著。白花蛇舌草總黃酮能在一定程度上對抗化療藥物的骨髓抑制，有望成為新輔助化療藥物，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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