9種中藥口服制劑微生物限度與控制菌檢查法的建立及方法學驗證

張小華，王婷婷，徐玉娥

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

細菌、霉菌和酵母菌計數是檢測非規定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是用于評價生產企業的藥用原料、輔料、設備、器具、工藝流程、環境和操作者的衛生狀況的重要手段和依據。由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測定方法或原測定法的檢驗條件發生改變時，可能影響檢驗結果的準確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進行驗證。而驗證的目的是確認所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。

本研究按照2010年版《中國藥典》(一部)微生物限度檢查法的規定，根據中藥制劑抑菌作用強度不同，采用常規法，培養基稀釋法進行9個品種醫院制劑的細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證及控制菌檢查方法的驗證，以建立適合該品種的微生物限度檢查方法。

1 材料

1.1 儀器 LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；SPX-智能型生化培養箱(寧波江南儀器廠)；MJX-智能型霉菌培養箱(寧波江南儀器廠)；METTLER AE240電子分析天平(賽多利斯公司)。

1.2 驗證用菌株 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、大腸埃希菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養基 PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：100328)、營養瓊脂培養基(批號：1003292)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：100409)、膽鹽乳糖培養基(批號：100429)、改良馬丁瓊脂培養基(批號：0912282)、曙紅亞甲藍瓊脂培養基(批號：090303)、營養肉湯培養基(批號：100319)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 樣品 健胃清腸合劑(批號：20130724，20130725，20130726)、復方萱草顆粒(批號：20130722，20130731，20130808)、通竅鼻淵丸(批號：20130401，20130415，20130425)、健胃消食合劑(批號：20130621，20130708，20130807)、健 胃 止 瀉 合 劑 (批 號 ：20130808，20130822，20131012)、健胃止血合劑(批號：20130514，20130717，20131202)、姜石腸炎康顆粒(批號：20130727，20130814，20130829)、清熱解毒合劑(批號：20130418，20130611，20130727)、痛風平顆粒(批號：20130725，20130806，20130827)以上制劑均由甘肅省中醫院藥學部制劑室提供。

2 方法與結果［1-7］

2.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，經30～35℃培養18～24小時。取上述肉湯培養物1mL，加9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級稀釋至菌數約為50～100 cfu/mL，做菌液組計數備用。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中25℃培養24～48小時后，用9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級稀釋至菌數約為50～100 cfu/mL，做菌液組計數備用。取經25℃培養7天的黑曲霉斜面培養物，加3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取霉菌孢子液1mL加9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍逐級稀釋為菌數約為50～100 cfu/mL，做菌液組計數備用。

2.2 供試液制備 液體樣品各取10mL，固體樣品各取10 g，加入pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，45℃水浴振搖，使樣品完全分散均勻，作為1∶10供試液；通竅鼻淵丸取10 g，加入pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，乳缽研勻，45℃水浴振搖，使樣品完全分散均勻，作為1∶10供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法選擇實驗及有效性驗證實驗

2.3.1 常規法 依法進行下列3組實驗，實驗組：分別取1mL 1∶10的供試液及50～100 cfu/mL的陽性菌液，同時加入平皿中，立即傾注20 mL 45℃左右的瓊脂培養基，每株陽性菌平行制備2個平皿，待凝固后，置規定溫度培養24～72小時觀察，按平皿法測定其菌數；菌液組：測定所加的陽性菌數；供試品對照組：取與實驗組同一供試液測定供試品本底菌數。

2.3.2 培養基稀釋法 取1 mL 1∶10的供試液，分別采用加0.5mL/皿、0.2mL/皿供試液及50～100 cfu實驗菌的方法，分別加入2～10個平皿中，同常規法進行其他操作。

2.3.3 計算回收率 回收率(%)=［(實驗組菌數－供試品組菌數)/菌液組菌數］×100%，《中國藥典》2010年版規定對各陽性菌株的回收率均不得低于70%。

2.3.4 細菌、霉菌及酵母菌計數方法選擇實驗 細菌、霉菌及酵母菌計數方法選擇實驗結果見表1—3。

表1 培養基稀釋度(0.5 mL/皿)法對各實驗菌株的回收率均值

表2 培養基稀釋度(0.2mL/皿)法對各實驗菌株的回收率均值

表3 常規法測定9種中藥制劑對各實驗菌株的回收率均值

由表1結果可見，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌用培養基稀釋法0.5mL/皿時，通竅鼻淵丸、清熱解毒合劑各陽性菌的回收率均＞70%，說明供試品稀釋至0.5mL/皿時，其抑菌活性可忽略不計，供試品中各類污染的細菌均能順利檢出；姜石腸炎康顆粒在用培養基稀釋法0.2mL/皿實驗時，陽性菌的回收率均＞70%，細菌可用培養基稀釋法(0.2mL/皿)進行實驗，霉菌及酵母菌均可用常規法進行實驗。

由表2結果可見，健胃清腸合劑、復方萱草顆粒、健胃消食合劑、健胃止瀉合劑、健胃止血合劑、痛風平顆粒6個品種用常規方法實驗，對陽性菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌、黑曲霉無抑菌作用，回收率均大于70%；通竅鼻淵丸、清熱解毒合劑、姜石腸炎康顆粒的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于70%，表明其具有一定的抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的作用，檢驗時應消除其抑菌活性后進行實驗。

2.4 控制菌大腸埃希菌及大腸菌群檢查方法有效性驗證［8］

2.4.1 大腸埃希菌 取1∶10供試液10mL及10～100 cfu大腸埃希菌加至100mL膽鹽乳糖培養基中，培養18～24小時后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。同法操作，加10～100 cfu金黃色葡萄球菌作陰性對照。

2.4.2 大腸菌群 取 1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1.0mL及10～100 cfu大腸埃希菌加至10mL膽鹽乳糖發酵培養基中，培養18～24小時后，按《中國藥典》2010年版控制菌檢驗方法檢查。同法操作，加10～100 cfu金黃色葡萄球菌作陰性對照。

結果表明，健胃清腸合劑等9個品種實驗組都檢出大腸埃希菌、陰性菌對照組都未檢出金黃色葡萄球菌，表明控制菌檢查方法學驗證實驗成立，即取1∶10供試液10mL或1mL按常規法進行控制菌檢查可行，在此條件下樣品溶液對控制菌大腸埃希菌無抑制作用。

3 討論

藥品污染微生物不僅危及患者用藥安全，而且也直接影響藥品的有效性。微生物限度檢驗中，確認供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除，才能保證檢驗結果真實反應制劑的微生物污染情況［9］。

中藥制劑成方藥味通常較多，抑菌活性強度不同，實驗過程中，對具有較強抑菌活性的制劑進行檢驗時，首選簡便有效的培養基稀釋法，抑菌作用強的制劑還可選擇離心沉淀法、薄膜過濾法等。通過實驗發現，健胃清腸合劑、復方萱草顆粒、健胃消食合劑、健胃止瀉合劑、健胃止血合劑、痛風平顆粒6個品種基本無抑菌活性，細菌、霉菌及酵母菌的檢驗均可采用常規法。姜石腸炎康顆粒、通竅鼻淵丸、清熱解毒合劑3個品種具有不同程度的抑菌活性，但可通過稀釋法消除抑菌作用。

由于控制菌檢查為一次性報告實驗結果，故應注意方法的有效性確認，以提高檢驗結果的可靠性。口服給藥制劑中，不含藥材原粉的制劑需要檢查大腸埃希菌，含藥材原粉的制劑除檢查大腸埃希菌外，還要進行大腸菌群的檢查。對9個品種的口服中藥制劑控制菌檢查方法有效性驗證結果表明，健胃清腸合劑等9個品種中藥制劑均可使用常規法進行控制菌檢查。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業出版社，2010：附錄79-86.

［2］ 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品中國藥品檢驗標準操作規范［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010：351-369.

［3］ 莫小林，伍小燕，韋振源，等.10種中藥制劑微生物限度檢查方法學的驗證［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(13):56-59.

［4］ 韋曦，邱雙成，王翠榮.29種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證［J］.中國藥房，2008，19(1):52-54.

［5］ 張小華，何曉英，劉效栓，等.安坤種子丸微生物限度檢測法的建立及方法學驗證.西部中醫藥，2013，26(11):19-21.

［6］ 霍昕，黃曉琦，劉建華，等.哮喘片微生物限度檢查法的建立及方法學驗證［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(15):121-124.

［7］ 閔紅，唐娜，尹良君.2種中藥制劑微生物限度與控制菌方法驗證［J］.西北藥學雜志，2013，28(3):301-303.

［8］ 朱會琴，李凱，王建寧，等.幾種中成藥的微生物限度檢查方法的探討［J］.中成藥，2007，29(12):附 4-附 7.

［9］ 謝愛麗.鋅硼散微生物限度檢查方法的驗證［J］.海峽藥學，2013，25(10):70-72.