骨碎補總黃酮對廢用性骨質疏松大鼠BMSCs成脂分化的影響及機制探討

高俊，胡繼紅，張曦(南京中醫藥大學附屬常州醫院，江蘇常州3003;常州市第二人民醫院)

骨碎補總黃酮對廢用性骨質疏松大鼠BMSCs成脂分化的影響及機制探討

高俊1，胡繼紅2，張曦1
(1南京中醫藥大學附屬常州醫院，江蘇常州213003;2常州市第二人民醫院)

摘要:目的觀察骨碎補總黃酮含藥血清對廢用性骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)成脂分化的影響，并探討其可能機制。方法57只SD雌性大鼠均制備廢用性骨質疏松模型，制模成功后將實驗大鼠分為4組。A組12只，不加任何干預; B組15只，術后常規喂養4周，后以辛伐他汀灌胃6周制備含藥血清; C組15只，術后常規喂養4周，后以低劑量骨碎補總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當于臨床劑量的5倍);d組15只，術后常規喂養4周，后以高劑量骨碎補總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當于臨床劑量的20倍)。大鼠用頸椎脫臼法處死，取原代BMSCs，并進行體外培養、傳代和純化，觀察各組成脂油紅染色情況，比較各組Wnt信號分子(Wnt3a)、低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)、過氧化物酶體增殖物激治受體(PPAR)γ2mRNA和蛋白。結果A、B、C、D組成脂油紅染色OD值分別為0.216 333±0.010、0.165 667±0.012、0.152 333±0.010、0.168 667±0.008，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05。A組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA分別為1.00±0.23、1.00±0.13、1.00±0.15，B組分別為3.71±0.25、3.47±0.18、0.46±0.21，C組分別為3.38±0.21、2.83±0.45、0.42±0.34，D組分別為2.98± 1.11、2.81±0.07、0.35±0.12，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05。A、B、C、D組Wnt3a蛋白分別為0.49± 0.14、0.72±0.11、0.75±0.10、0.78±0.15，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05; LRP6蛋白分別為0.62±0.19、0.95±0.16、1.07±0.23、1.12±0.25，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05; PPARγ2蛋白分別為0.30±0.04、0.27±0.06、0.48±0.08、0.45±0.09，A、B組分別與C、D組比較，P均＜0.05。。結論骨碎補總黃酮可抑制廢用性骨質疏松大鼠BMSCs成脂分化，其機制可能為上調Wnt3a、LRP6表達水平，并抑制PPARγ2表達。

關鍵詞:廢用性骨質疏松;骨髓間充質干細胞;成脂分化;過氧化物酶體增殖物激活受體;動物試驗

廢用性骨質疏松癥臨床上常見，多見于長期臥床、運動功能受限和長期制動，該疾病已經成為骨創傷疾病、骨關節疾病及骨關節疾病術后康復的重要障礙，甚至有發生骨質疏松性骨折的風險，影響原發疾病的治療和康復。經過長期實踐，確立了“腎主骨”的理論，并以“治未病”、“辨證施治”和“標本兼治”等整體治療觀為指導思想，在防治繼發骨質疏松中得到廣泛認同［1］。我們前期研究［2，3］表明，骨碎補總黃酮對廢用性骨質疏松大鼠血堿性磷酸酶、血清骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羥脯氨酸/尿肌酐、骨小梁節點數、游離末端數及股骨生物力學指標有不同程度改善作用，能促進骨形態發生蛋白2表達，表明骨碎補總黃酮有不同程度的成骨作用，可不同程度延緩或減輕大鼠廢用性骨質疏松的發生。本研究觀察了骨碎補總黃酮含藥血清對廢用性骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)成脂分化的影響，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康未生育3月齡SD雌性大鼠57

只，由江蘇大學實驗動物中心提供。動物合格證號: SCXK(蘇2009-0002)，發證機關:江蘇省實驗動物管理委員會。

［8］Murata S，Ladle BH，Kim PS，et al.OX40 costimulation synergizes with GM-CSF whole-cell vaccination to overcome established CD8+T cell tolerance to an endogenous tumor antigen［J］.J Immunol，2006，176(2): 974-983.

［9］Demirci G，Amanullah F，Kewalaramani R，et al.Critical role of OX40 in CD28and CD154-independent rejection［J］.Immunol，2004，172(3): 1691-1698.

［10］Gri G，Gallo E，Cario ED，et al.OX40 ligand-reansduced tumor cdll vaccine synergizes with GM-CSF and requires CD40 Ape signaling to boost the host T cell antitumor response［J］.J Immunol，2003，170(1): 99-106.

［11］Croftm.Control of immunity by the TNFR-relatedmolecule OX40(CD134)［J］.Annu Rev Immunol，2010，(28): 57-78.

［12］方敏，黃華梁.包涵體蛋白體外復性的研究進展［J］.生物生物學報，2001，17(6): 608-612.

1.2主要藥物及試劑強骨膠囊:購自北京歧黃制藥有限公司，每粒膠囊0.25 g，含骨碎補總黃酮有效成份0.18 g。10%胎牛血清，低糖DMEM培養液; L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤; EsyPure RNA Kit、TRIzol、Trants2KdNAmarkerdL2000、TaKaRa RNA PCR Kit Ver 3.0試劑盒; 10%甲醛，油紅，99%異丙醇，60%異丙醇，蘇木精，磷酸鹽緩沖液，四甲基乙二胺，麗春紅染液，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ2引物。

1.3廢用性骨質疏松模型制備及骨碎補總黃酮干預所有大鼠用10%水合氯醛(3mL/100 g)行腹腔麻醉，后暴露右側坐骨神經，于近髖處用銳利刀片切除坐骨神經，長約5mm，并將神經斷端打結處理，逐層縫合切口［4］。肌注慶大霉素0.1mL，以預防感染。將實驗大鼠分為4組。A組12只，不加任何干預; B組15只，術后常規喂養4周，后以辛伐他汀灌胃6周制備含藥血清; C組15只，術后常規喂養4周，后以低劑量骨碎補總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當于臨床劑量的5倍);d組15只，術后常規喂養4周，后以高劑量骨碎補總黃酮灌胃6周制備含藥血清(相當于臨床劑量的20倍)。

1.4原代BMSCs的體外培養A、B、C、D組大鼠用頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離出大鼠股骨，放入盛有PBS液平皿中，剔除附著的肌肉等組織，將股骨中間剪斷，用注射器吸取低糖DMEM培養液反復沖洗骨髓腔，以沖出骨髓，并制成單細胞懸液。將單細胞懸液離心(1 500 r/min，10min)，棄上清。加入含10% FBS的DMEM完全培養基，吹打散細胞。計數細胞并以1.07×102/mL的密度接種在培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.5大鼠BMSCs的傳代和純化利用差異貼壁培養法純化細胞。傳代:加MSCs消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液)，在倒置顯微鏡下觀察，至細胞間間隙增大、細胞變圓并開始脫落加入等量完全培養基終止消化，吹打瓶底，離心機離心(1 500 r/min，10min)，去上清，加入培養基，吹打散細胞，按1∶3傳代，消化5～15min，傳代細胞1～3min。

1.6油紅染色觀察用10%甲醛固定，再用60%異丙醇稍洗切片。經過10min油紅O液染色后用60%異丙醇漂洗殘余染液。清洗多余水分上甘油明膠封固。

1.7 Wnt信號分子(Wnt3a)、低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)、PPARγ2mRNA檢測采用

RT-PCR法。采用TRIzol法提取總RNA，將RTPCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外凝膠成像系統上照相，并記錄下每條DNA擴增帶的灰度值。

1.8 Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白檢測采用Western blotting法。清洗玻璃板，灌膠與上樣后行SDSPAGE電泳。然后進行轉膜和抗體的孵育，顯影后在凝膠圖像系統進行拍照。采用Image J軟件測定灰度值(以β-actin內參為基準)，每個數據測定3次取平均值。

1.9統計學方法采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組成脂油紅染色比較成脂誘導14d后各組BMSCs分化情況見圖1。A、B、C、D組成脂油紅染色OD值分別為0.216 333±0.010、0.165 667± 0.012、0.152 333±0.010、0.168 667±0.008，A組分別與B、C、D組比較，P均＜0.05。

圖1　成脂誘導圖14d后各組BMSCs分化情況(圖100×)

2.2各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA表達比較結果見表1。

表1　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA表達比較()

表1　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA表達比較()

注:與A組比較，*P＜0.05。

組別　Wnt3amRNA　LRP6mRNA　PPARγ2mRNA A組1.00±0.23　1.00±0.13　1.00±0.15 B組　3.71±0.25*　3.47±0.18*　0.46±0.21*C組　3.38±0.21*　2.83±0.45*　0.42±0.34*d組　2.98±1.11*　2.81±0.07*　0.35±0.12*

2.3各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白表達比較結果見表2。

表2　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白表達比較()

表2　各組Wnt3a、LRP6、PPARγ2蛋白表達比較()

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05。

組別　Wnt3a蛋白　LRP6蛋白　PPARγ2蛋白A組0.49±0.14　0.62±0.19　0.30±0.04 B組　0.72±0.11*　0.95±0.16*　0.27±0.06 C組　0.75±0.10*　1.07±0.23*　0.48±0.08＊△D組　0.78±0.15*　1.12±0.25*　0.45±0.09＊△

3　討論

BMSCs具有干細胞的共性，即具有自我復制和多向分化能力［5］。體外不同誘導條件下，BMSCs能夠向成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞及基質細胞等不同的細胞系分化［6］。體外實驗研究［7］發現，在BMSCs與不同濃度的脂肪細胞的共培育體系中，隨著脂肪細胞濃度上升，BMSCs內堿性磷酸酶相對活性下降。由此認為髓內脂肪細胞干擾了BMSCs的成骨能力，可能與骨質疏松癥的發病有關。以上實驗提示骨質疏松癥BMSCs向成骨細胞分化的能力降低，向脂肪細胞分化能力增強，導致成骨細胞數量和功能降低。干預BMSCs分化因素的研究是目前眾多學科研究的熱點，通過抑制BMSCs向脂肪細胞分化，達到預防和治療骨質疏松的目的，也將成為防止廢用性骨質疏松癥的一種新途徑。

影響脂肪細胞分化的各種因素最終都是通過調節轉錄因子的途徑誘導脂肪分化的，其中主要的轉錄因子PPARγ在脂肪細胞的分化過程中起到關鍵作用［8］。文獻［9］報道，PPARγ尤其是PPARγ2可介導脂質累積和脂肪細胞特異性基因的表達。PPARγ2作為一種核受體，可調節BMSCs由骨細胞向脂肪細胞轉化，從而抑制骨形成，增強骨髓脂肪生成，這可能是活化的PPARγ2導致機體骨量減少的重要機制。Gustafson等［10］發現，PPARγ2激活有可能通過抑制Wnt/β-catenin通路促進脂肪生成從而抑制了骨生成。目前，PPARγ2所介導的脂肪細胞特異性基因表達與廢用性骨質疏松之間關系尚無文獻報道。

骨碎補總黃酮是補腎壯骨中藥骨碎補的主要活性成分，是以柚皮苷為主的二氫黃酮類化合物，其制劑也是目前用來防治骨質疏松的主要中成藥之一［11］。現代藥理研究［12］證實，骨碎補總黃酮具有增加骨量、改善骨質量、維持骨微結構的完整程度、增強成骨細胞活性、促進成骨細胞分化與增殖、促進鈣在骨的沉積、增強骨的礦化及調節骨代謝過程中的細胞因子、抑制骨吸收等作用。國內學者觀察骨碎補總黃酮對老年骨質疏松癥患者骨痛和骨密度的影響，發現骨碎補總黃酮治療組骨密度均有明顯上升，且對骨痛的緩解效果明顯優于對照組［13］。有學者通過離子導入骨碎補總黃酮治療骨質疏松癥，發現該方法對于緩解骨質疏松癥患者腰腿疼痛及提高腰椎骨密度有明顯的療效［14］。

本研究顯示，A組成脂油紅染色OD值均高于B、C、D組。說明各藥物干預組向脂肪細胞分化降和低，可以間接促使成骨細胞數量增多和成骨功能增強。本研究還發現，A組Wnt3a、LRP6、PPARγ2mRNA低于B、C、D組，Wnt3a、LRP6蛋白低于B、C、D組，PPARγ2蛋白低于C、D組; B組PDARγ2蛋白低于C、D組。說明骨碎補總黃酮含藥血清可以抑制廢用性骨質疏松癥大鼠BMSCs成脂過程中PPARγ2mRNA的表達，從而起到抑制BMSCs成脂分化的作用。

參考文獻:

［1］高俊，張前德.“腎主骨”理論與破骨細胞骨吸收［J］.中醫雜志，2012，53(7): 547-549.

［2］高俊，張前德，張曦，等.益腎護骨方對廢用性骨質疏松的改善作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，2(23): 179-182.

［3］高俊，張前德，胡繼紅.廢用性骨質疏松動物模型發生骨質疏松時間段的研究［J］.江蘇醫藥，2012，38(10): 1145-1147.

［4］高俊，張前德，胡繼紅，等.廢用性骨質疏松動物模型的建立與評價［J］.廣東醫學，2012，33(18): 2728.

［5］Lysdahl H，Baatrup A，Foldager CB.Preconditioning humanmesenchymal stem cells with a low concentration of BMP2 stimulates proliferation and osteogenicdifferentiation in vitro［J］.Biores Open Access，2014，3(6): 278-85.

［6］Yang W，Both SK，van Osch GJ.Effects of in vitro chondrogenic priming time of bone-marrow-derivedmesenchymal stromal cells on in vivo endochondral bone formation［J］.Acta Biomater，2015，(13): 254-265.

［7］Fu Y，Li R，Zhong J.Adipogenicdifferentiation potential of adipose-derivedmesenchymal stem cells from ovariectomizedmice ［J］.Cell Prolif，2014，47(6): 604-614.

［8］Zhao XY，Chen XY，Zhang ZJ.Expression patterns of transcription factor PPARγ and C/EBP familymembersduring in vitro adipogenesis of human bonemarrowmesenchymal stem cells［J］.Cell Biol Int，2015，39(4): 457-465.

［9］Janani C，Ranjitha Kumari BD.PPAR gamma gene--a review［J］.Diabetesmetab Syndr，2015，9(1): 46-50.

［10］Gustafson B，Eliasson B，Smith U.Thiazolidinediones increase the wingless-typemMTV integration site family(WNT)inhibitordickkopf-1 in adipocytes: a link with osteogenesis［J］.Diabetologia，2010，53(3): 536-540.

［11］劉偉，趙勁民，蘇偉，等.骨碎補總黃酮可促進兔骨髓間充質干細胞的增殖和分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(32): 6021-6026.

［12］丁小剛，覃勇，鄂建設，等.骨碎補總黃酮對老年性骨質疏松癥患者血清骨鈣素水平及骨密度影響［J］.中國骨質疏松雜志，2013，19(5): 519-521.

［13］曾年，王月義，裘邯軍，等.骨碎補總黃酮對老年骨質疏松癥骨痛和骨密度的影響［J］.山東中醫雜志，2013，6(20): 387-388.

［14］樊繼波，覃勇，李莎，等.離子導入骨碎補總黃酮對骨質疏松癥患者腰椎骨密度影響臨床研究［J］.中國骨質疏松雜志，2013，3(12): 1256-1258.

收稿日期:( 2015-04-10) ( 2015-04-25)

基金項目:江蘇省中醫藥局科技項目(BL13010);常州市科技計劃項目(CJ20112014)。

文章編號:1002-266X(2015)35-0028-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R714

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.009