肺部真菌感染患者的白色念珠菌基因分型及藥物敏感性

裴柳，左志剛，李亞卓，任翔宇，陳宏偉，王東，郝殿晉(秦皇島市第一醫院，河北秦皇島066000)

肺部真菌感染患者的白色念珠菌基因分型及藥物敏感性

裴柳，左志剛，李亞卓，任翔宇，陳宏偉，王東，郝殿晉
(秦皇島市第一醫院，河北秦皇島066000)

摘要:目的了解肺部真菌感染患者標本的白色念珠菌分離株基因分型和藥物敏感性。方法肺部真菌感染患者60例，從患者痰液標本中分離并鑒定出白色念株菌60株，對其進行ABC基因分型及對抗7種藥物的敏感性試驗;其中10例肺部與腹腔同時感染患者再取痰液和腹腔引流液，進行分離菌株的基因分型。結果60株肺白色念珠菌感染標本中，A型30株(50.0%)，B型26株(43.3%)，C型4株(6.7%); 10例肺部與腹腔同時感染患者中有2例存在不同部位基因型別不同。白色念珠菌分離株對5-氟胞嘧啶、兩性霉素、制霉菌素、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑的耐藥率分別為20.0%、0、0、40.0%、33.3%、50.0%、45.0%，其中基因型A型耐藥率分別為23.0%、0、0、47.6%、33.3%、57.1%、52.4%，B型分別為15.4%、0、0、26.9%、26.9%、42.3%、34.6%，C型分別為25.0%、0、0、62.5%、50.0%、62.5%、62.5%。結論肺部真菌感染患者的白色念珠菌基因分型A、B型比例相當，同一患者不同部位可以有不同基因型別的菌株感染。60株分離菌對5-氟胞嘧啶、兩性霉素、制霉菌素耐藥率低，對4種唑類藥物耐藥率高。

關鍵詞:白色念珠菌;基因分型;藥敏試驗

危重癥患者由于自身免疫力低下、長期使用大量的廣譜抗生素、皮質類固醇激素等藥物以及各種介入性治療，易導致深部真菌感染，誘發死亡［1］。白色念珠菌是一種條件致病性真菌，可侵犯機體各系統、器官及組織，臨床表現為急性、亞急性或慢性炎癥［2］。目前，基因分型技術已成為白色念珠菌感染診斷及流行病學研究中的前驅技術。本研究對60例肺部真菌感染患者標本的白色念珠菌分離株進行基因分型和藥物敏感性分析，用以指導臨床合理用藥。

1　資料與方法

1.1臨床資料白色念珠菌感染患者60例，男39例，女21例;年齡50～90歲;原發病:重癥胰腺炎19例，復合性外傷術后18例，腦出血15例，心肺復蘇8例。收集所有感染患者的深部痰液標本，對分離株進行基因分型和藥敏分析。其中10例患者存在肺部與腹腔同時感染，取此10例患者的痰液和腹腔引流液分離株進行基因分型。

1.2菌株分離鑒定標本接種2，3，5-氯化三苯四氮唑沙保弱培養基，于37℃溫箱培養24 h觀察結果。白色念珠菌菌落呈白色或淡粉色，其他酵母菌為紫紅色或亮紅色菌落。挑取呈白色或淡粉色菌落，劃線接種于CHROMagar Candida(法國科瑪嘉)顯色培養基，37℃培養24 h觀察結果，菌落呈現綠色或翠綠色判定為白色念珠菌。再通過厚膜孢子形成實驗，芽管形成實驗，最終鑒定出白色念珠菌。

1.3白色念珠菌基因組DNA提取采用Tiangen Biotech(Beijing)Co.Ltd酵母樣真菌基因組DNA提取試劑盒的方法加以改良，成功提取出每株白色念珠菌的基因組DNA［3］。

1.4分離株基因分型采用ABC法［4，5］。基于核糖體DNA序列在進化過程中的保守性，廣泛用于多種生物的鑒定、分型。白色念珠菌基因組內編碼rRNA的基因即rDNA為串聯重復序列，100～200個拷貝，包括編碼25S RNA、18S RNA和5.8S RNA的基因。在25S rDNA編碼區內存在一可轉座Ⅰ型內含子，內含子中至少存在3個插入片段，大小為252、341、379 bp。形成可轉座Ⅰ型內含子的大小可有3種: 379 bp(插入379 bp片段)、621 bp(插入252 bp、379 bp片段)、962 bp(插入252 bp、379 bp、341 bp片段)，本方法借助聚合酶鏈式反應(PCR)擴增白色念珠菌包含Ⅰ類內含子的編碼25S rRNA 的rDNA保守序列區域，根據擴增條帶大小對白色念珠菌分離株進行基因分型。設計特定引物，并由北京奧科生物技術有限責任公司合成，引物序列: 5'-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3'，5' -CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3 '。

采用DNA瓊脂糖凝膠電泳技術分離出不同大小的基因產物，依據ABC分型原則: A型: 450 bp條帶(無內含子); B型: 840 bp條帶(379 bp內含子); C 型:450 bp和840 bp兩條帶(379 bp可轉座內含子對基因中核糖體串聯區的不對稱插入);d型: 1 080 bp條帶(621 bp內含子); E型: 1 400 bp條帶(962 bp內含子)。

1.5藥物敏感性試驗藥敏試驗采用Fungus-7-念珠菌藥敏測定試驗條，由8對小孔組成，其最后一對小孔中不含任何抗生素，作為對照孔。另7對小孔中含有7種高低濃度的抗生素，將接種酵母菌的培養基加入小孔中，35℃孵育24 h，滴加顯色液，肉眼觀察結果，耐藥孔為淡藍色，敏感孔為紅色或淡紅色。質控菌株選用ATCC90028。

2　結果

2.1白色念珠菌分離株基因分型60株肺白色念珠菌感染標本中，A型30株(50.0%)，B型26株(43.3%)，C型4株(6.7%)。10例肺部與腹腔同時感染患者中，A型10株，B型6株，C型4株;其中有2例患者痰液和引流液感染基因型不同，分別是痰液B型、引流液C型，提示同一患者不同部位可以不同基因型菌株感染。

2.2白色念珠菌對常見抗菌藥物的耐藥情況結果見表1和表2。

表1　白色念珠菌對常見抗菌藥物的耐藥情況(%)

表2　不同基因型白色念珠菌對常見抗菌藥物的耐藥情況(%)

3　討論

文獻［6～10］報道，基因分型技術已成為研究念珠菌流行病學及合理選擇藥物的基礎。本研究顯示，60例外科重癥患者的白色念珠菌感染標本出現A、B、C三種型別，未見D型和E型。亓慶國等［11］報道的兒童口腔白色念珠菌分型結果以A型為主，Chen等［12］報道的臺灣地區分型結果中A型與B型比例相當。本文結果與Chen等結果相似，A型B型比例相當。提示不同地區或不同部位感染的白色念珠菌基因型別的分布比例不同。

本研究中有10例患者存在肺部與腹腔同時感染，取痰液和腹腔引流液分離菌株進行基因分型，結果均以A型居多，其次是B型與C型，未見D型與E型，其中2例患者痰液和腹腔引流液的基因分型不同，分別是痰液B型，腹腔C型。表明同一患者不同部位感染的白色念珠菌可以是不同基因型菌株。分析原因，白色念珠菌B型菌株有Ⅰ類內含子379 bp片段的完全插入，C型含Ⅰ類內含子379 bp片段的不對稱插入，但A型則完全缺乏此379 bp片段，本次結果2例患者不同部位存在不同型別感染，我們推測可能由于內含子的379 bp片段在白色念珠菌種內從C型到B型的水平轉移。但感染究竟是菌株基因型別的轉變還是不同基因型菌株的再感染尚無定論，還需要更多的菌株分析和其他分型方法共同驗證。

60株白色念珠菌對5-氟胞嘧啶、兩性霉素B和制霉菌素的敏感度較高，與文獻［13，14］報道一致，三者的敏感度分別為76.7%、95.0%、68.3%。兩性霉素B的敏感性最高，是治療真菌感染的金標準，但兩性霉素臨床毒性較大。除5-氟胞嘧啶有菌株耐藥外，兩性霉素B和制霉菌素無一耐藥。值得關注的是制霉菌素的中度敏感率最高，潛在的耐藥性是不容忽視的，目前臨床上僅限對其局部應用［15］。5-氟胞嘧啶干擾真菌核酸的合成及其功能，但該藥單獨使用可能導致10%～15%的耐藥性產生。本研究表明，5-氟胞嘧啶耐藥率達20.0%，有資料顯示該藥與兩性霉素B或三唑類藥物合用可以減少耐藥菌株的產生［16］。咪康唑、益康唑、伊曲康唑和氟康唑均屬唑類抗真菌藥物，60株白色念珠菌菌株對唑類抗真菌藥物的敏感度分別為51.7%、60.0%、45.0%、48.3%。伊曲康唑的耐藥率最高，此與胡羅文等報道一致，咪康唑為40%、益康唑為33.3%、氟

康唑為45.0%。由結果可見4種唑類藥物耐藥性和敏感性數值接近，提示可能存在交叉耐藥現象。而從單一菌株的藥敏實驗結果分析得出，60株標本中，有20株標本對4種唑類藥物全部耐藥。真菌對唑類藥物的耐藥現象日益嚴重，現有部分研究人員致力于唑類藥物耐藥的研究［17］。

本研究應用ABC分型法將60株白色念珠菌分為A、B、C三型，并對60株標本進行藥敏試驗。發現白色念珠菌的基因型與其對抗真菌藥物的敏感性有一定的相關性，國內外有過類似的研究報道，但也只是猜測，尚無統一定論。本文結果所示ABC三型均未出現兩性霉素B和制霉菌素的耐藥株，A型菌株對5-氟胞嘧啶的耐藥率高于B型，這與McCullough等［18］報道一致。據推測25S rDNA中Ⅰ型內含子的出現可能與白色念珠菌對5-氟胞嘧啶的敏感性有關，該內含子具有自我剪切功能，對于形成成熟的25S rRNA是必要的。但這種剪切功能可被堿基抑制。因此，含有25S rDNAⅠ類內含子的菌株B型和C型對堿基類似物的藥物，如5-氟胞嘧啶更為敏感。本次結果B型對5-氟胞嘧啶敏感度高于C型與A型，印證了這種推測。A型菌株不含內含子，C型菌株僅含有部分內含子，也可以理解為B型菌株的內含子丟失向A型菌發展過程中形成C型菌。如前分析同一患者不同時期采集的標本存在型別變化，而且均由B型變為C型，除了二次感染的推斷以外，還可能由于反復應用抗真菌藥物，使得菌株發生保護性基因突變，B型菌株的內含子丟失逐漸向A型轉變，而其中間階段可能形成含有部分內含子的C型菌，菌株轉變為A型后，耐藥性有所提高［19］。本研究顯示，不同基因型的菌株對咪康唑、益康唑、伊曲康唑和氟康唑的耐藥率由高到底依次為C型、A型、B型，4種唑類藥物出現一致性，可能與唑類藥物的交叉耐藥性有關。此結果與卓佳等［20］報道有些不同。

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·綜述·

收稿日期:( 2015-04-25)

文章編號:1002-266X(2015)35-0085-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R379.4

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.033