HPLC法測定甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物中有關物質的含量

王冬，周健鵬，王晨（1.國家腫瘤臨床醫學研究中心/天津市腫瘤防治重點實驗室/天津醫科大學腫瘤醫院藥學部，天津 300060；.天津市藥品檢驗所，天津 300070）

甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物作為一種新型的丙烯酸樹脂，具有理化性質穩定、無毒、無刺激性、不被人體吸收等諸多優點[1-2]，可廣泛用于藥物制劑領域，作為緩、控釋制劑的包衣材料[3-6]。其有關物質主要為甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的單體成分。為有效控制甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物的質量，本試驗建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定其中甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯兩種單體成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1314A可變波長檢測器（VWD）、ChemStation色譜工作站等（美國Agilent公司）；e2695型HPLC儀，包括2489可變波長檢測器、Empower色譜工作站等（美國Waters公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

甲基丙烯酸對照品（批號：190011-120801）、丙烯酸乙酯對照品（批號：190018-120921）、3批甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物樣品（批號：20111204、20111205、20111206）及1批甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物仿制品均由天津某制藥公司提供；試劑均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（取含十二個結晶水的磷酸氫二鈉8.953 g、磷酸二氫鉀3.400 g，加水溶解并稀釋至1000 ml，用稀磷酸調pH至2.0）（30∶70，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：202 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：20 μl[7-8]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯對照品各約10 mg，置于同一100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取50 ml，精密加入水25 ml，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約2 g，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取50 ml，精密加水25 ml，搖勻，即得。

2.2.3 空白對照溶液 精密量取50 ml甲醇置于100 ml量瓶中，精密加水25 ml，搖勻，即得。

2.3 系統適用性和專屬性試驗

取“2.2”項下的空白對照溶液、對照品溶液和供試品溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，甲基丙烯酸峰與丙烯酸乙酯峰在該色譜條件下可有效分離，分離度大于1.5；理論板數按甲基丙烯酸峰計算不低于1000；空白對照不干擾樣品中有關物質的測定。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液1、2、4、6、8、10、15 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇-水（2∶1，V/V）稀釋制成質量分數分別為0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.010%、0.015%的系列溶液。分別精密量取20 μl，注入HPLC儀，記錄色譜，以質量分數為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，得甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的回歸方程分別為y＝127 790x－19.98 和y＝102 548x+18 975（r＝0.999 4、0.999 1）。結果表明，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯質量分數均在0.001%～0.015%范圍內均與其峰面積呈良好的線性關系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 檢測限和定量限

精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，采取逐步稀釋法測定，按照信噪比為3計算，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯檢測限均為0.1 μg/ml；按照信噪比10計算，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯定量限均為0.3 μg/ml。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次。結果，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

2.7.1 對照品溶液 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液適量，于室溫放置0、2、4、8、25 h時分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，甲基丙烯酸的峰面積分別為172 425、173 297、172 911、172 600、173 103，丙烯酸乙酯的峰面積分別為157 644、157 124、156 708、153 313、153 698，RSD分別為0.2%和1.3%，表明對照品溶液在25 h內質量基本穩定。

2.7.2 供試品溶液 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液（批號：20111205），精密量取適量，于室溫放置0、2、4、8、22 h時分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，甲基丙烯酸的峰面積分別為12 110、12 087、12 165、12 125、11 970，RSD為0.6%，丙烯酸乙酯均未檢出，表明供試品溶液在22 h內質量基本穩定。

2.8 重復性試驗

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液（批號：20111206），共6份，分別精密量取20 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯含量。結果，甲基丙烯酸含量均為0.001%，丙烯酸乙酯均未檢出，兩者RSD均＜2%，表明該方法的重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20111204）約2 g，精密稱定，共9份，分別置于9個100 ml量瓶中，各精密加入“2.2.1”項下對照品貯備液4、4、4、5、5、5、6、6、6 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯含量，結果詳見表1。

2.10 耐用性試驗

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

采用不同的廠家的儀器和色譜柱進行耐用性試驗，條件1：Waters e2695型HPLC儀，Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；條件2：Agilent 1100型HPLC儀，Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。結果，本方法的耐用性良好，詳見表2。

表2 耐用性試驗結果（n＝3）Tab 2 Results of durability test（n＝3）

2.1 1 樣品中有關物質含量測定

分別取3批樣品及1批仿制品各適量，按“2.2”項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用外標法以峰面積計算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的含量，結果詳見表3。

表3 樣品中有關物質含量測定結果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of related substances in samples（n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物是一種新型腸溶水性包衣材料，目前國內外均未見到其有關物質含量檢測的報道。因此，在其檢測波長的選擇上筆者參考了2010年版《中國藥典》（二部）聚甲丙烯酸銨酯Ⅱ中有關物質檢查所用的波長，最終選定202 nm作為本品有關物質檢測的波長。

3.2 流動相pH的選擇

由于本品的有關物質檢測中涉及的組分呈酸性，因此流動相的pH對分離效果影響較明顯。本試驗將緩沖液pH用稀磷酸分別調制至2.0、3.0、4.0，結果pH為2.0時分離效果最佳。

3.3 雜質限度的確定

2010年版《中國藥典》（二部）聚甲丙烯酸銨酯Ⅱ有關物質檢測項下提及的雜質為甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯，要求總雜質不得過0.3%。本研究中3批樣品及1批仿制品的有關物質含量測定結果顯示，單個雜質均小于0.005%，總雜質均小于0.01%。故初步擬定本品有關物質限度為：單個雜質不得大于0.005%，總雜質不得過0.01%。

3.4 回收率的影響因素

本研究中，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的平均加樣回收率不高，分別為86.59%和91.24%。究其原因可能是由于：首先檢測波長為202 nm，屬于末端紫外吸收，氧氣對測定干擾較大；其次兩者的定量限均為0.3 μg/ml，樣品中單體雜質含量很低。但兩者平均加樣回收率均大于80%，仍符合雜質檢測回收率的有關要求。

綜上所述，本方法簡單、準確、重復性好，可用于甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物中有關物質的含量測定，并可為該輔料的質量標準的建立奠定基礎。本研究結果表明，該共聚物性質穩定，聚合率高，有關物質符合規定。

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