膦甲酸鈉對高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其機制

胡春燕，徐金升，石博，張俊霞，白亞玲，崔立文，張慧然，張勝雷(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

膦甲酸鈉對高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其機制

胡春燕，徐金升，石博，張俊霞，白亞玲，崔立文，張慧然，張勝雷(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

摘要:目的研究膦甲酸鈉(PFA)對高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)鈣化的影響及可能的作用機制。方法體外原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定后，分別加入10mmol/L的β-甘油磷酸(HP組)和10mmoL/L HP +1mol/L PFA(PFA組)，另設(shè)空白對照組。測定各組細(xì)胞鈣含量，并分別用RTPCR和Western blotting法檢測VSMCs核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)mRNA及蛋白在不同時間點的動態(tài)表達(dá)情況。結(jié)果HP組和PFA組細(xì)胞鈣含量均高于空白對照組(P均＜0.05)，且PFA組細(xì)胞鈣含量較HP組明顯降低(P＜0.05)。HP組Cbfα1mRNA和蛋白的表達(dá)呈“峰-谷-峰”樣(P＜0.05)，且第一峰值高于第二峰值(P＜0.05); PFA 組Cbfα1mRNA表現(xiàn)為第二高峰前移，分別于6 h及1d達(dá)峰(P均＜0.05)，而蛋白水平達(dá)峰時間延后，分別于12 h 和4d達(dá)峰(P＜0.05)，且第二峰值均低于第一峰值(P＜0.05)。結(jié)論PFA能抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化，其可能是通過影響高磷誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞:血管平滑肌細(xì)胞;膦甲酸鈉;β-甘油磷酸;鈣化;核心結(jié)合因子α1

Effect andmechanism of phosphonoformic acid on β-glycerophosphate-incudced calcification in rat vascular smoothmuscle cells

HU Chun-yan，XU Jin-sheng，SHI Bo，ZHANG Jun-xia，BAI Ya-ling，CUI Li-wen，
ZHANG Hui-ran，ZHANG Sheng-lei
(The Forth Hospital of Hebeimedical University，Shijiazhuang 050011，China)

Abstract:Objective To explore the effect andmechanism of phosphonoformic acid(PFA)on β-glycerophosphateincudced calcification in rat vascular smoothmuscle cells(VSMCs).Methods Primary VSMCs obtained from rat thoracic aorta in vitro were cultured.After being identified withmorphological and immunocytochemistry，VSMCs were added with 10mmol/Lβ-glycerophosphate(HP group)and 10mmol/L HP + 1mmol/L PFA(PFA group)，meanwhile，the control group was set.RT-PCR and Western blot were used todetect the expression ofmRNA and protein of core binding factor α1(Cbfα1)atdifferent time points，respectively.Results Compared with the control group，the cell calcification in the HP group and PFA group was increased(all P＜0.05)，while compared with HP group，the calciumdeposition was significantly reduced in the PFA group(P＜0.05).In the HP group，the expression ofmRNA and protein of Cbfα1 were in a “peak-valley-peak”trend(P＜0.05)，and the first peak was higher than the second one(P＜0.05).In the PFA group，the second peak of Cbfα1mRNAmoved forward，which reached the top at 6h and 1d respectively(all P＜0.05).Unlike the expression ofmRNA，the protein of Cbfα1 reached the top at 12h and 4d，respectively(P＜0.05)，and the second peak was lower than the first one(P＜0.05).Conclusion PFA inhibits β-glycerophosphate-incudced VSMCs calcification possibly by affecting the hyperphosphate-induced phenotypic transdifferentiation of VSMCs.

Key words:vascular smoothmuscle cells; phosphonoformic acid;β-glycerophosphate; core binding factor α1

血管鈣化在終末期腎臟病(ESRD)患者中普遍存在，且與正常人相比，ESRD患者血管鈣化的程度重，血管壁開始出現(xiàn)鈣沉積的年齡更小［1］。有研究表明，血管鈣化的存在及其嚴(yán)重程度是ESRD患者心血管

病死率及全因病死率的獨立預(yù)測因子［2］。血管鈣化主要導(dǎo)致血管壁僵硬度增加，脈壓增大以及左室肥厚［3］，進(jìn)而引起血流動力學(xué)異常，導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生，因此研究血管中膜鈣化的抑制因素及其機制對于降低ESRD患者的心血管病死率具有重要意義。目前研究表明，高磷血癥是血管中膜鈣化的獨立危險因子，而抑制細(xì)胞對磷的攝取可抑制鈣化，但其機制尚不明確。2013年3～10月，本實驗以高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化為基礎(chǔ)，探討磷轉(zhuǎn)運體抑制劑膦甲酸鈉(PFA)對其鈣化的影響及可能機制。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物:健康雄性SD大鼠6只，5周齡，80～100 g(清潔級)，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(合格證號: 1303093)。主要實驗試劑和儀器:胎牛血清(Hyclone公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，β-甘油磷酸(Scientific research special公司)，PFA(Sigma公司)，總蛋白提取試劑盒(索萊寶公司)，BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶公司)，鈣含量檢測試劑盒(北京中生北控公司)，兔抗鼠平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(北京博奧森生物有限公司)，鼠抗鼠Cbfα1單克隆抗體(Abcam)，兔抗人GADPH多克隆抗體(杭州賢至生物科技有限公司)，熒光標(biāo)記的抗兔及抗鼠二抗(Cell Signaling公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司); CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(Nikon公司，型號: TE2000-U)，凝膠成像系統(tǒng)(Image公司)，PCR儀(ABI公司，型號5700型)。

1.2 VSMCs的體外培養(yǎng)SD大鼠麻醉后在超凈工作臺內(nèi)迅速取其胸主動脈，剝除血管外膜，縱行剖開血管，無菌紗布擦除破壞內(nèi)膜，應(yīng)用組織塊貼壁法進(jìn)行VSMCs原代培養(yǎng)，并進(jìn)行鑒定。

1.3 VSMCs的鑒定及實驗分組形態(tài)學(xué)觀察:應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等。免疫細(xì)胞化學(xué)染色:六孔板內(nèi)用消毒的蓋玻片制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長至60%～70%時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌1～2次，95%乙醇固定30min，PBS洗2次，每次2min，加入α平滑肌肌動蛋白抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育30min后滴加鏈親和素生物素復(fù)合物，37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染后，鏡下觀察。經(jīng)自然純化后，選取生長良好的3～5代細(xì)胞進(jìn)行實驗。將VSMCs隨機分為空白對照組、HP組(培養(yǎng)基含10mmol/L β-甘油磷酸)和PFA組(培養(yǎng)基含10% FBS + 10mmol/L β-甘油磷酸+ 1mmol/L PFA)。24 h更換一次培養(yǎng)液。檢測VSMCs鈣含量，并于處理后6 h、12 h、1～5d檢測Cbfα1的mRNA及蛋白表達(dá)情況。

1.4 VSMCs鈣含量測定取生長狀態(tài)良好的3代VSMCs接種于6孔板中，干預(yù)5d后，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用0.6mol/L稀鹽酸脫鈣取上清，應(yīng)用鈣含量檢測試劑盒測定細(xì)胞鈣含量;脫鈣后的細(xì)胞用0.1mol/L NaOH和0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解30min后取上清，BCA法測定細(xì)胞蛋白含量，結(jié)果以細(xì)胞鈣含量比蛋白含量(mg/g蛋白)表示。實驗每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.5 VSMCs Cbfα1mRNA測定TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)的轉(zhuǎn)錄情況。應(yīng)用primer 5.0軟件設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Cbfα1(289 bp):上游引物5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3'，下游引物5'-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3'; GAPDH(496 bp):上游引物5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，下游引物5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。采用目的基因與內(nèi)參進(jìn)行同管擴增，計算相對含量，實驗重復(fù)3次。

1.6 VSMCs Cbfα1蛋白測定按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白后，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，應(yīng)用Western blotting法測定蛋白表達(dá)量，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗(GAPDH 1∶1 000，Cbfα1 1∶500)稀釋液，4℃孵育過夜。洗膜，加入熒光二抗稀釋液(1∶10 000)，室溫下孵育1 h，用免疫熒光成像系統(tǒng)顯色，采用Gel-pro4圖像分析軟件分析條帶灰度值，實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 PFA對高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的影響第5天時，空白對照組、HP組、PFA組鈣含量分別為(27.10±3.36)、(83.53±5.77)、(47.18±6.84)mg/g蛋白，與空白對照組相比，HP組和PFA組細(xì)胞鈣含量均明顯增加(P均＜0.05)，PFA組低于HP 組(P＜0.05)。

2.2 PFA對高磷誘導(dǎo)的VSMCs Cbfα1mRNA及其蛋白表達(dá)的影響給予高磷刺激后，HP組VSMCs中各時間點Cbfα1mRNA及蛋白表達(dá)均高于空白對照組(P均＜0.05)。且隨著時間的延長，Cbfα1

mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升(6 h第一次達(dá)峰，P＜0.05)、后下降(mRNA在12 h達(dá)最低，蛋白在1d達(dá)最低，P均＜0.05)、之后再次升高(3d再次達(dá)峰，P＜0.05)的趨勢，呈現(xiàn)“峰-谷-峰”的特點，且第二峰值高于第一峰值(P＜0.05)。PFA組Cbfα1mRNA及蛋白的表達(dá)雖仍呈雙峰趨勢(P均＜0.05)，但與HP組相比，PFA組Cbfα1mRNA表現(xiàn)為第二高峰前移，分別于6 h及1d達(dá)峰(P均＜0.05)，且第二峰值低于第一峰值(P均＜0.05);而Cbfα1在蛋白水平的達(dá)峰時間有所后延，分別于12 h和4d達(dá)峰(P均＜0.05)，且第二峰值仍低于第一峰值(P＜0.05)。見圖1、圖2，表1、表2。

圖1　HP組不同時間點Cbfα圖1mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)情況

表1　HP組不同時間點Cbfα1mRNA及蛋白的表達(dá)情況()

表1　HP組不同時間點Cbfα1mRNA及蛋白的表達(dá)情況()

注:與0 h相比，*P＜0.05;與其他時點相比，#P＜0.05;與6 h相比，△P＜0.05。

時間點　Cbfα1mRNA　Cbfα1蛋白0 h　0.028±0.007　0.276±0.071 6 h　0.672±0.037*　1.143±0.085*12 h　0.368±0.094* #　0.903±0.135*1d　0.566±0.063*　0.350±0.122#2d　0.763±0.048*　1.259±0.212*3d　1.034±0.015* #△　1.644±0.236＊△4d　0.759±0.027*　1.479±0.074*5d　0.485±0.101*　1.083±0.418*F 78.935　17.772 P ＜0.01　　＜0.01

3　討論

ESRD患者是心血管疾病的高危人群，心血管疾病約占其死亡原因的50%［4］，居于首位。眾所周知，動脈鈣化是心血管疾病重要的危險因素，也是慢性腎臟病骨和礦物質(zhì)代謝異常的突出表現(xiàn)。我們前期關(guān)于62例ESRD患者橈動脈病理的研究顯示，有40.3%的患者存在血管鈣化，且均為中膜鈣化［5］。而應(yīng)用尿毒癥血清刺激可使VSMCs發(fā)生鈣化［6］。

高磷血癥是血管鈣化的獨立危險因素，也是其心血管事件及全因死亡率的重要且獨立的非傳統(tǒng)危險因素，而控制高磷血癥則可以降低ESRD患者病死率［7］。高磷血癥在ESRD患者中十分普遍，一項對維持性血液透析患者的大型、多國聯(lián)合調(diào)查顯示，50%左右的患者存在高磷血癥［8］。磷從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)主要是由鈉依賴的磷共轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的，有研究顯示，在VSMCs上有Ⅲ型鈉依賴的磷共轉(zhuǎn)運體Pit-1和Pit-2存在，而Ⅰ型和Ⅱ型沒有檢測到，且Pit-1含量較高，Pit-2含量較少［9，10］，敲除Pit-1后能

顯著減少人VSMC的鈣化［11］。PFA是鈉磷共轉(zhuǎn)運體的競爭性抑制劑，能以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞的磷攝取［10］。所以本實驗選用PFA干預(yù)VSMCs，觀察其對高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的影響。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，高磷能誘導(dǎo)血管鈣化，而抑制磷攝取后可以減輕血管鈣化的程度，但不能完全消除高磷對VSMCs的影響。

圖2　PFA組不同時間點Cbfα圖1mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)情況

表2　PFA組不同時間點Cbfα1mRNA及蛋白的表達(dá)比較()

表2　PFA組不同時間點Cbfα1mRNA及蛋白的表達(dá)比較()

注:與0 h相比，*P＜0.05;與其他時點相比，#P＜0.05;與1d相比，△P＜0.05;與12 h相比，▲P＜0.05。

時間點　CbfαlmRNA　Cbfαl蛋白0 h　0.048±0.002　0.233±0.039 6 h　0.947±0.113* #△　0.618±0.111*12 h　0.262±0.032*　1.260±0.231* #1d　0.624±0.111* #　0.910±0.263*2d　0.348±0.054*　0.460±0.062 3d　0.333±0.045*　0.565±0.132 4d　0.398±0.017*　0.951±0.107＊▲5d　0.263±0.056*　0.476±0.054 F 52.050　15.371 P ＜0.01　　＜0.01

目前的研究認(rèn)為，VSMCs發(fā)生成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化在血管鈣化中起關(guān)鍵作用，而Cbfα1是其中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。已有實驗表明Cbfα1的表達(dá)上調(diào)與血管鈣化程度具有相關(guān)性［12，13］。我們前期的實驗結(jié)果顯示，高磷可誘導(dǎo)Cbfα1呈“峰-谷-峰”樣的動態(tài)改變［14］。為了進(jìn)一步明確PFA抑制VSMCs鈣化的可能機制，我們對各組VSMCs Cbfα1的動態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。本研究結(jié)果顯示，給予高磷刺激后，Cbfα1mRNA的表達(dá)情況與我們之前的研究結(jié)果相似，Western blotting法檢測其蛋白表達(dá)也呈類似的“雙峰樣”變化趨勢。而在PFA組不論是在轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平，Cbfα1的表達(dá)仍呈“雙峰”，但在mRNA水平上第二高峰明顯前移;在蛋白水平的達(dá)峰時間有所后延，且第二峰值仍低于第一峰值。提示PFA通過抑制磷攝取后能影響Cbfα1的表達(dá)情況，進(jìn)而對抑制VSMCs的表型轉(zhuǎn)化起了一定作用，至少抑制其進(jìn)一步的轉(zhuǎn)分化。但PFA組中仍有Cbfα1的表達(dá)，可能與所應(yīng)用的濃度及刺激時間有關(guān)。

綜上所述，PFA能抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，其機制可能是通過影響高磷誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的。但具體的信號通路還需進(jìn)一步深入探討，從而為慢性腎臟病患者血管鈣化的防治提供理論基礎(chǔ)。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-06-07)

通信作者簡介:徐金升(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病及血液凈化相關(guān)并發(fā)癥及機制方面研究。E-mail: xls5766@126.com

作者簡介:第一胡春燕(1976-)，女，主治醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病血管鈣化發(fā)病機制方面研究。E-mail: huchunyan0309@126.com

基金項目:河北省自然科學(xué)基金資助項目(H2012206157)。

文章編號:1002-266X(2015)37-0022-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R692.5

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.007