AG490對大鼠腦缺血損傷的保護作用及其機制

高延才，杜愛玲，張林朋，張合鵬，曹少鵬，王振剛，季泰令(濰坊醫學院，山東濰坊6053;濰坊醫學院附屬醫院)

AG490對大鼠腦缺血損傷的保護作用及其機制

高延才1，杜愛玲2，張林朋1，張合鵬1，曹少鵬1，王振剛2，季泰令2(1濰坊醫學院，山東濰坊261053;2濰坊醫學院附屬醫院)

摘要:目的研究JAK激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)信號通路的阻斷劑AG490對大鼠腦缺血損傷的保護作用，并探討其作用機制。方法用健康SD大鼠制作大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，隨機分為四組:mCAO組、假手術組、高劑量AG490干預組和低劑量AG490干預組。MCAO組采用左側頸外動脈插栓法造模;假手術組不插栓，結扎并剪斷左側頸外動脈，夾閉左側頸總動脈1 h后撤動脈夾，縫皮;高劑量AG490干預組和低劑量AG490干預組在造模成功后1 h分別給予腹腔注射6、3mg/kg AG490，MCAO組和假手術組給予等量生理鹽水。動物麻醉清醒后6、12、24 h，應用神經功能行為學評分評價腦缺血損傷程度;動物麻醉清醒后24 h用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色技術檢測腦組織梗死范圍，ELISA法檢測腦組織內腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)水平。結果大鼠麻醉清醒后24 h，與假手術組比較，MCAO組、高劑量AG490干預組和低劑量AG490干預組神經功能行為學評分、TNF-α和IL-1β水平高，腦組織梗死范圍大(P＜0.05或＜0.01);與MGAO組比較，高劑量AG490干預組、低劑量AG490干預組神經功能行為學評分低，TNF-α、IL-1β水平低，腦組織梗死范圍小(P均＜0.01)。結論AG490對大鼠腦缺血損傷具有保護作用，其作用是通過抑制JAK/STAT信號傳導通路、減輕炎癥反應實現的。

關鍵詞:腦缺血; AG490; JAK激酶;信號轉導和轉錄激活因子;大鼠

腦血管病在人類各種疾病死因中一直位于前3位，成為人類死亡的主要原因。其中缺血性腦血管病(ICVD)臨床較多見，約占全部腦血管病患者的85%，最為常見的是大腦中動脈栓塞(MCAO)引起的。由于大鼠的腦血管分布與人腦部血管類似，而且愈合能力強、易于飼養、便于操作，因此本實驗采用了目前常見的大鼠MCAO模型。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，是JAK激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)信號通路的阻斷劑［1］。目前研究表明，JAK/STAT信號轉導途徑參與中樞神經系統的多個生物學分化過程，與腦外傷、腦腫瘤、免疫反應機制等相關［2］。2014年10月～2015年6月，我們就AG490對腦缺血損傷的作用及其作用機制進行了相關探討。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠，體質量250～280 g(北京斯貝福實驗動物科技有限公司)，潔凈動物房飼喂，大鼠自由飲水進食，飼喂3d，適應環境后進行試驗; AG490(美國BioLegend公司); 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京化學試劑公司); TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(北京環亞泰克生物醫學技術有限公司)。

1.2動物分組與MCAO模型建立依據隨機數字表將大鼠分為4組:假手術組、MCAO組、低劑量AG490(3mg/kg)干預組和高劑量AG490(6mg/kg)干預組。大鼠均采用腹腔注射麻醉(10%水合氯醛0.3mL/100 g)，MCAO組采用頸外動脈插栓法，做頸正中切口，暴露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內動脈，將0.26mm單絲尼龍魚線頭端0.5 cm用石蠟包被，并于20mm處標記，大鼠均通過左側ECA切口處插入，栓線長度自CCA分叉處18～20mm，根據動物體質量而定，栓塞左側大腦中動脈，然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。缺血達到2 h后小心抽出栓線，即形成再灌注。假手術組只是不插入尼龍魚線，其余步驟同MCAO組。低劑量AG490干預組和高劑量AG490干預組分別于術前24 h給予3mg/kg和6mg/kg的AG490腹腔注射，其余步驟同MCAO組。在缺血期間及再灌注后2 h保持體溫在(37±0.5)℃。以大鼠手術麻醉清醒后出現右側肢體癱瘓，站立不穩，提尾時向一側轉圈為模型成功的判斷標準。

1.3腦缺血損傷程度的評價采用神經行為學評分。參考Ergul等［3］的5分制法，在動物麻醉清醒后6、12、24 h進行評分。0分:無神經損傷癥狀; 1 分:不能完全伸展對側前爪; 2分:向對側轉圈; 3分:向對側傾倒; 4分:不能自發行走，意識喪失。分值越高，說明動物行為障礙越嚴重。

1.4腦組織梗死范圍的檢測采用TTC染色法。動物麻醉清醒后24 h將大鼠斷頭，取出完整的腦組織，迅速置于－20℃的冰箱中，凍存20min。切成5～6片，每隔2mm切一片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處;第二刀在視交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間［4］。切片應均勻。將切片置于TTC中，常規濃度為2%，用錫箔紙蓋住后，放入37℃恒溫箱15～30min，不時翻動腦片，保證均勻接觸到染色液。最后，數碼相機拍照，計算機計算梗死區域體積所占大腦半球總體積的百分比。

1.5腦組織TNF-α和IL-1β測定動物麻醉清醒后24 h，選取栓塞缺血同側的大鼠腦組織，勻漿處理腦組織，然后離心，取上清液。采用ELISA法，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定腦組織TNF-α 和IL-1β水平。

1.6統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，神經行為學評分比較采用秩和檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組不同時間神經行為學評分比較見表1。

表1　各組不同時間神經行為學評分比較(分，)

表1　各組不同時間神經行為學評分比較(分，)

注:與MCAO組同期比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別　n 24 h神經行為學評分動物麻醉清醒后6 h動物麻醉清醒后12 h動物麻醉清醒后假手術組　10　0＊＊　0＊＊　0＊＊MCAO組　15 1.82±0.58 2.10±0.47 2.68±0.49低劑量AG490干預組　15 1.67±0.73 2.05±0.80 1.82±0.85*高劑量AG490干預組　15 1.65±0.96 1.98±1.02 1.73±0.62*

2.2各組腦組織梗死范圍比較假手術組無腦組織梗死發生，MCAO組腦組織梗死范圍為(16.84± 4.60)%，低劑量AG490干預組為(10.37± 2.60)%，高劑量AG490干預組為(8.26±3.07)%。MCAO組、高劑量AG490干預組和低劑量AG490干預組腦組織梗死范圍均高于假手術組(P均＜0.01);高劑量AG490干預組、低劑量AG490干預組和MCAO組腦組織梗死范圍依次增高(P均＜0.01)。

2.3各組腦組織TNF-α和IL-1β水平比較見表2。

表2　各組腦組織TNF-α和IL-1β水平比較(mg/g，)

表2　各組腦組織TNF-α和IL-1β水平比較(mg/g，)

注:與MCAO組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別　n　TNF-α　IL-1β假手術組　10　0.354±0.070＊＊1.647±0.377＊＊MCAO組　10　1.301±0.348　2.703±0.467低劑量AG490干預組　10　0.625±0.220*1.632±0.340＊＊

3　討論

目前，面對日益加重的老齡化問題，心腦血管疾病已經成為危害人們身體健康的主要疾病，其發病率呈現逐年增高的趨勢。腦缺血損傷后的區域主要表現為炎癥反應，包括氧自由基產生、水解酶生成、溶酶體破壞、白細胞聚集以及炎癥介質形成等方面。腦缺血損傷后的一系列炎癥反應，最終會導致血腦屏障受損，內皮細胞的參與會加重腦損害，引起腦水腫。以上的病理生理過程中會有各種各樣的炎性因子參與其中，包括TNF-α和IL-1β。

IL-1β是IL-1在腦組織中主要的活性形式，可由內皮細胞和神經膠質細胞等多種活性細胞合成和分泌。其不僅能協同其他細胞因子促進T、B細胞活化，還能誘導其他炎癥介質產生，增強內皮細胞與白細胞的黏附，調節TNF-α和IL-6的產生［5，6］。目前認為，IL-1β是一種重要的炎性因子，其失控性表達是炎癥反應失控性發生、發展的重要因素，是反映腦缺血急性期損傷程度的標志物［7］。它誘導的炎癥反應與JAK/STAT信號通路密切相關［8］。TNF-α具有觸發和級聯放大炎癥反應的作用，是誘導過度炎癥反應的關鍵性促炎因子，在缺血性腦血管病的發病機制中起重要作用，是腦缺血形成后腦組織梗死的主要原因［9，10］。其可誘導細胞黏附因子表達，增加血管內皮細胞通透性，導致炎癥介質釋放和聚集，在腦缺血損傷后期的炎癥細胞浸潤和組織損傷中發揮很大作用，因此降低TNF-α的表達是對腦缺血損傷后神經功能障礙的一種保護性措施。本研究結果顯示，與假手術組比較，MCAO組、高劑量AG490干預組和低劑量AG490干預組神經功能行為學評分、TNF-α和IL-1β水平高，腦組織梗死范圍大;與MCAO組比較，高劑量AG490干預組、低劑量AG490干預組神經功能行為學評分低，TNF-α、IL-1β水平低，腦組織梗死范圍小。提示AG490可通過降低TNF-α和IL-1β水平，抑制炎癥反應從而起到腦組織保護作用。

研究表明，眾多細胞內的信號轉導需要借助JAK-STAT信號轉導通路，其在缺血性腦血管病中的作用越來越受到關注［11］。本實驗采用的干預藥物AG490是一種選擇性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制劑，能有效地阻斷下游信號轉導和轉錄激活子STAT的活化，特異性地抑制JAK-STAT信號轉導通路，從而有效地阻斷其信號通路的信號轉導過程。結果顯示采用AG490阻斷JAK-STAT信號轉導通路后，大鼠腦缺血損傷后的神經功能損傷程度減輕、腦組織梗死范圍縮小和炎癥反應減輕，因此推斷AG490通過抑制JAK-STAT信號轉導通路保護腦缺血損傷。

參考文獻:

［1］Fenyo IM，Florea IC，Raicum，et al.Tyrphostin AG490 reduces NAPDH oxidase activity and expression in the aorta of hypercholesterolemic apolipoprotein E-deficientmice［J］.Vascul Pharmacol，2011，54(3-6): 100-106.

［2］Kondylim，Gatzounis G，Kyritsis A，et al.Immunohistochemicaldetection of phosphorylated JAK-2 and STAT-5 proteins and correlation with erythropoietin receptor(EpoR)expression status in human brain tumors［J］.J Neurooncol，2010，100(2): 157-164.

［3］Ergul A，ElgebalymM，MiddlemoremL，et al.Increased hemorrhagic transformation and altered infarct size and localization after experimental stroke in a ratmodel type 2diabetes［J］.BMC Neurol，2007，(7): 33.

［4］張均田.現代藥理實驗方法［M］.北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998: 1382，1409-1413.

［5］BenningerdH，Georgiadisd，Kremer C，et al.Mechanism of ischemic infarct in spontaneous carotiddissection［J］.Stroke，2004，35(2): 482-485.

［6］Castellanosm，Castillo J，GarcíamM，et al.Inflammation-mediateddamage in progressing lacunar infarctions: a potential therapeutic target［J］.Stroke，2002，33(4): 982-987.

［7］Clark WM，Rinker LG，Lessov NS，et al.Lack of interleukin-6 expression is not protective against focal central nervous system ischemia［J］.Stroke，2000，31(7): 1715-1720.

［8］Jee SH，Chu CY，Chiu HC，et al.Interleukin-6 induced basic fibroblast growth factor-dependent angiogenesis in basal cell carcinoma cell line via JAK/STAT3 and PI3-kinase/Akt pathways［J］.J Investdermatol，2004，123(6): 1169-1175.

［9］Sairanen T，Carpén O，Karjalainen-LindsbergmL，et al.Evolution of cerebral tumor necrosis factor-alpha productionduring human ischemic stroke［J］.Stroke，2001，32(8): 1750-1758.

［10］Fenyo IM，Florea IC，Raicum，et al.Tyrphostin AG490 reduces NAPDH oxidase activity and expression in the aorta of hypercholesterolemic apolipoprotein E-deficientmice［J］.Vascul Pharmacol，2011，54(3-6): 100-106.

［11］Ke JJ，Wang YL，Li JG，et al.Pretreatment effect of adenosine on activation of NF kappaB and level of TNF-alphaduringmyocardial ischemia and reperfusion in rats［J］.Chin J Traumatol，2004，7(1): 25-27.

·臨床研究·

收稿日期:( 2015-07-06)

文章編號:1002-266X(2015)37-0031-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R651.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.010