椎間盤退變細胞及分子療法研究進展＊

胡 松，羅興燕，劉 陽，鄒 強

成都醫(yī)學院 科研實驗中心（成都 610083）

正常椎間盤（intervertebral disc，IVD）既承載著人體外力負荷，同時又保證了脊椎的靈活性。IVD的相關(guān)組織包括纖維環(huán)（annulus fibrosus，AF）、髓核（nucleus pulposus，NP）及軟骨終板，這種結(jié)構(gòu)決定了IVD是細胞結(jié)構(gòu)少、無血管、低氧和低營養(yǎng)的酸性環(huán)境。機械損傷、營養(yǎng)供應、細胞活性、機制成分及新陳代謝等因素導致IVD組織脫水、纖維化、神經(jīng)和血管向內(nèi)生長，最后導致組織損失和IVD突出。本文擬將近年來針對IVD疾病的細胞和分子療法作一綜述。

1 引言

根據(jù)Global Burden of Disease Study最新公共健康報道，全球約有6.32億人受腰背痛影響，其中IVD突出比例為10%～15%，并呈上升趨勢。腰背痛也是導致殘疾的原因之一［1］。

1.1 正常IVD的結(jié)構(gòu)與功能

IVD屬于多層次器官，包括中心的NP、包裹NP的AF，以及起到連接脊椎作用的軟骨終板［2］。NP的功能為吸收脊椎受到的機械壓力。AF的主要功能是對NP釋放的滲透壓提供張力作用。小分子可以滲透軟骨終板，為IVD細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)［3］。細胞的低密度和大量的胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）適合于厭氧代謝，進而導致低氧含量及高乳酸鹽含量和低pH水平。

1.2 IVD的退變機制

NP中蛋白聚糖的流失伴隨組織脫水并最終使組織纖維化。AF則可能發(fā)生裂紋，結(jié)構(gòu)能力減弱使得NP發(fā)生突出。腰痛和腿痛的原因在于相鄰的神經(jīng)受到來自脫出NP的壓力或刺激［4］。病變被認為是遺傳因素和外在致病條件間的復雜相互作用，其中遺傳因素發(fā)揮著重要作用，大量結(jié)合基質(zhì)蛋白或代謝介質(zhì)基因改變的研究說明其能增加IVD退變的風險。因此，了解上述方面及定位疼痛來源對疾病的針對性治療至關(guān)重要。

2 IVD特殊微環(huán)境特征

IVD復雜的解剖結(jié)構(gòu)為脊柱提供了靈活性和外力吸收能力。NP、AF和軟骨終板的特殊結(jié)構(gòu)為細胞提供了獨一無二的微環(huán)境，是IVD中重要的無血管結(jié)構(gòu)。營養(yǎng)素和代謝物能通過液體流通或擴散經(jīng)終板和AF抵達IVD中心。IVD的其他特性包括低細胞結(jié)構(gòu)和細胞流動性低、pH低和含大量多糖。進一步定義這種特殊環(huán)境結(jié)構(gòu)是后續(xù)研究的必要基礎(chǔ)，并且在研究新療法時，須考慮如何保存原有結(jié)構(gòu)。

3 體內(nèi)平衡重建中的細胞補充

3.1 IVD細胞移植

過去20年，通過自體軟骨細胞移植修復軟骨的方法已經(jīng)建立，然而移植方法似乎很難運用于IVD，因為通過活檢方式取IVD細胞并不可行，穿刺健康IVD易導致其退變［5］。少數(shù)細胞可以取自于IVD摘除術(shù)或脊柱融合術(shù)，但這些細胞似乎并不健康且有老化可能。不過，已有研究表明，IVD細胞移植安全且有助于減低疼痛。為了提高IVD細胞在基質(zhì)中的增殖能力和活力，將從IVD組織中分離的細胞與間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）共培養(yǎng)。短期共培養(yǎng)在沒有染色體異常和腫瘤發(fā)生的情況下可顯著提高人NP細胞生長和蛋白多糖合成［6］。最新研究［7］表明，NP細胞的低溫儲藏具有可行性；冷藏細胞和新鮮細胞在增殖和基質(zhì)產(chǎn)物上沒有顯著區(qū)別，使不從手術(shù)過程獲得移植細胞的可能性大大增加。

3.2 MSCs移植與再生機制

注射MSCs作為IVD細胞和軟骨細胞的替代細胞，在動物模型和臨床上已有廣泛研究。脂肪組織衍生MSCs對IVD的修復能力是已知的，但骨髓卻是MSCs獲取的最大來源［8］。10個腰IVD退變患者通過NP內(nèi)注射給藥接受 MSCs［9］，可安全、迅速地改善疼痛，其效果與脊椎融合術(shù)、IVD置換術(shù)不相上下，但MSCs對退變IVD的修復機制還未完全闡明。由于NP細胞的表型和形態(tài)學觀察與軟骨細胞相似，所以軟骨細胞標記分子如Sox-9、aggrecan和typeⅡcollagen已被普遍用于分析和評估分化得來的IVD樣細胞。雖然已有關(guān)于IVD細胞特異性標記物的研究，但仍不確定骨髓和脂肪組織衍生的MSCs是否能分化成具有天然表型的NP細胞。另外，通過誘導細胞產(chǎn)生的新基質(zhì)修復IVD的機制也不明了。但是MSCs的修復能力在很大程度上可能是因為其通過旁分泌刺激、細胞間接觸或細胞膜成分交換，從而活化NP細胞［10］。注射MSCs后，可能因為MSCs的抗炎作用，也可能因為其合成代謝方面的效應，會使疼痛得到長期緩解。

3.3 細胞運載系統(tǒng)

移植細胞保留、活化和分化能力需要適當?shù)募毎\載系統(tǒng)。用于細胞運載和IVD組織工程的天然與合成聚合物支架以及水凝膠的研究已經(jīng)展開。由于NP的高含水量結(jié)構(gòu)，注射水凝膠系統(tǒng)不僅提供了結(jié)構(gòu)支撐，也很適合細胞的運用和保持。雖然水凝膠在提升細胞功能上得到大多數(shù)人的認可，但其機械性能還不能完全滿足機械支撐的需求。如需承受快速和直接的負荷，那么組織替換材料則需要更強韌的機械性能。柔軟的水凝膠包括纖維、膠原、透明質(zhì)酸和殼聚糖等，運用于退變早期時只有少量結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化。目前較推薦的是Ⅱ膠原和透明質(zhì)酸的交聯(lián)物質(zhì)，它們可作為NP退變時的注射物質(zhì)［11］。最近發(fā)現(xiàn)，在體外研究和器官培養(yǎng)中［12］，穩(wěn)定的纖維－透明質(zhì)酸聚合物可促進產(chǎn)生能與組織整合的NP細胞基質(zhì)。由此，透明質(zhì)酸因?qū)χ委熜约毎哂械纳镙d體性質(zhì)而被考慮廣泛運用。

3.4 祖細胞歸巢

為了避免細胞移植風險，再生細胞遷移至損傷位置作為不同的觀點已有研究。在自然修復過程中，受損細胞和組織釋放信號吸引祖細胞回到損傷位點。歸巢所需特殊趨化分子取決于組織修復及生長因子、細胞因子和趨化因子［13］。進一步研究顯示應答不良營養(yǎng)、壓力負荷及穿刺時，IVD釋放趨化分子并增加骨髓衍生干細胞遷移。IVD分泌的趨化因子CCL5/RANTES和CXCL6是體外研究時補充 MSCs的關(guān)鍵因子［14］。此外，用IL-1和 TNF－α處理NP細胞，趨化因子CCL3表達上調(diào)，這些趨化因子可能提高祖細胞歸巢和巨噬細胞對IVD浸潤［15］。因此，適當平衡補充細胞或趨化因子在調(diào)節(jié)細胞和基質(zhì)比例上面起重要作用。

4 生物活性因子/基因運輸

4.1 蛋白/小分子運輸

為了重建退化早期生理平衡，遞送生物因子動員或活化細胞可能比自體或異體細胞移植更直接。IVD退化和疼痛發(fā)生相關(guān)機制已有報道，且已有療法在體內(nèi)注射生長因子，包括成骨蛋白1（osteogenic protein 1，OP-1）和 生 長 分 化 因 子（growth and differentiation factor 5，GDF-5）及小分子［16］。富含血小板血漿（PRP）或血小板溶解物也包含多種生長因子和蛋白，能增強細胞生長和功能，有助于組織修復。多種體外和體內(nèi)研究［17］顯示，PRP對IVD再生具有陽性效果，然而在遞送生物因子的同時也應該研究如何防止炎癥、血管生成和骨生成。

4.2 基因遞送系統(tǒng)

與單純注射蛋白相比，基因療法更具有持久性優(yōu)勢。IVD中已有研究的治療性基因可以編碼代謝合成 因 子 （BMPs、GDF-5、LMP-1）、轉(zhuǎn) 錄 因 子（Sox-9）［18］、炎癥拮抗劑（IL-1Ra）［19］或金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-1）［20］。目前有病毒性和非病毒性兩類基因傳遞載體，大部分研究則使用腺病毒作為載體。有報道以腺病毒為載體遞送基因GDF-5［21］或BMP誘導蛋白（lim mineralization protein 1，LMP-1）［22］，可在IVD中增加基質(zhì)沉積并修復其功能。然而，感染和產(chǎn)生免疫反應是病毒性基因傳送系統(tǒng)附帶的潛在風險。非病毒性基因傳遞系統(tǒng)則更加安全，但其最大缺點是基因傳遞效率太低，目前在IVD中只有少數(shù)報道使用非病毒傳遞系統(tǒng)。最近更多的研究者［23］致力于高效非病毒基因遞送方法，因而非病毒性基因遞送有望成為治療IVD的優(yōu)勢療法。

5 胞內(nèi)信號通路療法

多種胞內(nèi)信號通路在IVD細胞退變中已有研究。胞內(nèi)信號通路是保持體內(nèi)環(huán)境平衡通信系統(tǒng)的重要部分，并且大部分信號通路在不同細胞中都有相似作用。對于IVD中特異信號通路的研究目前成為熱點。氧濃度、機械應力和炎癥因子等通過細胞因子或生長因子都可以活化IVD細胞內(nèi)信號通路。

5.1 NF-κB和MAPK信號通路

主要信號通路NF－κB和 MAPK調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)，如 TNF－α、IL-1β及IL-6，并且已有鑒定［24］表明，兩種通路在肌肉骨骼疾病中是炎癥和分解代謝的主要調(diào)控因子。抑制NF－κB信號通路已被考慮可用于治療IVD突出或聯(lián)合性疼痛。最近在老化相關(guān)IVD退變中，已有研究［25］使用藥物和基因阻斷NF－κB信號通路。大鼠IVD突出模型中［26］，當 NF－κB誘導寡聚脫氧核苷酸被局部控制于背根神經(jīng)節(jié)時，大鼠機械觸痛和熱痛覺過敏出現(xiàn)顯著抑制。Ercc1小鼠可用于抑制NF－κB，NF-κB抑制則可通過基因敲除或是通過腹膜注射藥物Nemo Binding Domain（8K-NBD）。8K-NBD可封閉 NF－κB上游活化因子IκB誘導激酶（IKK）的形成。相比幼齡野生型小鼠，早衰樣Ercc1小鼠盤內(nèi)NF－κB活化被顯著提高，并且衰老表現(xiàn)與野生型小鼠自然衰老相似。NF-κB活化的上調(diào)與IVD中蛋白聚糖含量相關(guān)，Ercc1小鼠中通過8K-NBD封閉NF－κB信號，增加IVD中蛋白聚糖積累，緩解IVD細胞和基質(zhì)疾病。

MAPK在IVD中也同樣被認為可作為抗炎和抗分解代謝的靶點。使用IL-1β誘導炎性因子或分解代謝時，加入姜黃素后可顯著下調(diào)IL-6、MMP1、MMP3和 MMP13的水平。潛在信號通路分析［27］顯示，TLR2表達的下調(diào)和MAPK/JNK的抑制，可活化p38和ERK。此外，靶激酶的抑制療法可顯著增加蛋白聚糖含量、合成和釋放［28］。

5.2 Wnt信號通路

Wnt信號通路作為IVD疾病中的相關(guān)介質(zhì)已有描述。Wnt信號通路分為 Wnt/β－連環(huán)蛋白依賴和非β－連環(huán)蛋白依賴兩類，后者又進一步分為二維細胞極性通路和Ca2＋通路［29］。用Wnt活化劑LiCl處理NP細胞可加速細胞老化［30］。此外，對IVD中不同信號通路的相互作用研究［31］表明，使用LiCl處理NP細胞導致β－連環(huán)蛋白在mRNA和蛋白水平中上調(diào)；同時原癌基因（c-myc）和細胞周期蛋白D1的抑制可活化 Wnt/β－連環(huán)蛋白通路，從而下調(diào)細胞增殖。另有研究檢測β－連環(huán)蛋白條件（cAct）小鼠中的分解代謝基因表達，觀察顯示在β－連環(huán)蛋白基因敲除小鼠IVD細胞中，MMP13和ADAMTS5基因表達上調(diào)，與IVD退變特征相符。此外，cAct小鼠IVD的退變可通過抑制MMP13進行阻斷，提示β－連環(huán)蛋白是保持IVD功能與結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)因子［32］。

6 小結(jié)與展望

過去10年，IVD退變的生物療法在分子醫(yī)學技術(shù)和理論方面都有很大進展。隨著IVD疾病特性相關(guān)理論的積累，將有更多更好的療法能運用于不同類型的IVD退變疾病中。內(nèi)源性修復的提升和功能性干細胞歸巢可能阻止IVD退變的發(fā)生。相對于異種NP，干細胞療法有IVD特異性祖細胞性狀，并可能發(fā)揮更大效應。在基礎(chǔ)動物研究的臨床化中，藥物療法將繼續(xù)作為重要治療手段使用。胞內(nèi)信號通路的持續(xù)性研究將為更多信號通路療法提供治療靶點，從而調(diào)節(jié)IVD細胞及體內(nèi)平衡保持系統(tǒng)。

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