Klotho 基因及其蛋白與心血管疾病的關系

王 歡，魏 玲

目前心血管疾病治療措施主要包括控制危險因素、藥物及手術治療，但心血管疾病發病率仍居高不下，成為全球范圍內危及生命的重要問題。 Klotho 基因是1997 年由日本學者Kuro-o 等在進行性自發性高血壓的相關研究時偶然發現的新型抗衰老基因，其通過調節鈣磷代謝、抗氧化應激及炎癥反應、促進內皮細胞一氧化氮釋放、調節離子通道以及其他信號轉導通路等，對心血管系統發揮保護作用。 本文對Klotho 基因及其蛋白做一綜述，旨在探討兩者與多種心血管疾病的關系

1 Klotho 基因

Klotho 基因是根據傳說中掌握人生命線的希娜女神命名的， 于1997 年首次發現在自發性高血壓模型大鼠的腎臟高表達。 人Klotho 基因由5 個外顯子和4 個內含子構成，位于13 號染色體（13q12），全長約50 kb。 實驗動物中，敲除Klotho 基因小鼠過早呈現出與衰老相關的表型，如內皮功能損傷、血管鈣化、動脈粥樣硬化、皮膚萎縮、肺氣腫、糖代謝異常、骨質疏松等，甚至導致壽命縮短[1]。在人類，Klotho 基因多態性與冠狀動脈疾病、中風、長壽等密切相關[2]。

2 Klotho 蛋白

因不均一，核hRNA 選擇性剪接產生兩種不同形式的Klotho 蛋白，即膜型Klotho 蛋白和分泌型Klotho 蛋白。 膜型Klotho 蛋白屬于單次通道跨膜蛋白， 在正常成人的腎小管上皮細胞高度表達[3]，其由細胞內的羧基短結構域和構成兩個同源性片段（KL1、KL2）的細胞外氨基末端結構組成[4]。 膜型Klotho 蛋白作為FGF23 的必須輔因子，能調節FGF23/FGFR 信號通路， 提高FGF-23 與其受體的結合力，促進腎臟磷酸鹽排泄，同時FGF-23 能抑制腎臟Klotho蛋白的表達[5]。 膜型Klotho 蛋白的全長胞外區域可以水解或經Klotho mRNA 選擇性剪切分泌到血液、腦脊液、尿液中，稱為分泌型Klotho 蛋白，其是人Klotho 蛋白的主要類型，比膜型蛋白功能上發揮更大的作用[6]。 分泌性Klotho蛋白作為體液因子，具有抗氧化、調節腎臟離子通道、抑制Wnt 信號及抗凋亡及衰老等作用[7]。

盡管Klotho 蛋白主要表達在有限的器官中， 但突變后能引起全身器官衰老相關癥狀[8]。 供體年齡及機體內環境變化能影響Klotho 蛋白的表達。 隨著機體衰老尤其在40 歲以后，血清Klotho 水平顯著減少[9]。 Richard 等[2]研究發現， 血漿中Klotho 高表達是社區成年居民較少發生心血管疾病，如冠狀動脈疾病、心力衰竭、外周動脈疾病的獨立保護因素。 多元回歸分析發現：在排除其他心血管危險因素后， 血清Klotho 蛋白和血管內皮Klotho 基因的低表達與心血管疾病的發生及嚴重程度呈密切相關[10]。 在慢性腎透析患者中， 血清中Klotho 低表達與患者腹主動脈鈣化呈正相關，其具有診斷價值[11]。

3 Klotho 與血管疾病

研究發現，在主動脈內膜及中膜血管平滑肌細胞內也有Klotho 表達[12]。 Klotho 通過各種機制保護血管功能，如抑制血管緊張素Ⅱ誘導的活性氧族的產生、保護細胞衰老及凋亡、抗炎癥反應、維持內皮細胞完整性、促進NO 的產生、改善動脈順應性。

3.1 Klotho 抑制內皮細胞衰老 預防內皮細胞衰老可能是預防心血管疾病發生的有利機制。 體外實驗，在過氧化氫誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡與衰老模型中， 過表達Klotho 蛋白使Caspase-3、Caspase-9、P53、P21 活性比對照組明顯降低[13]。

在慢性腎臟疾病中，尿毒癥毒素、氧化應激、前炎癥因子等加速了內皮細胞過早衰老及凋亡。尿毒癥毒素通過增加活性氧簇及激活NFκB， 降低了細胞內Klotho 的表達，促進了細胞衰老和表達衰老相關蛋白P16、P21、P53。通過抑制50%的Klotho 基因表達后發現，細胞端粒酶縮短，證實Klotho 降低導致了細胞衰老。 外源性給予Klotho 后，內皮細胞衰老現象明顯改善， 可能與抑制氧化應激及穩定NFκB/IκB 有關[14]。 研究進一步發現，激活FGF23/Klotho 信號肽能預防組織萎縮， 刺激細胞增殖和抑制維生素D 誘導的細胞凋亡， 表明FGF23/Klotho 軸具有抗衰老的治療潛力[15]。

3.2 Klotho 促進內皮細胞NO 產生 給予乙酰膽堿后，雜合子小鼠（Kl+)和純合子小鼠（Kl/Kl)主動脈壁的最大舒張功能仍明顯降低，尿中氮氧代謝物量（NO2-、NO3-)減少，血管內皮細胞釋放內源性NO 減少，提示Klotho 可能通過增加NO 產生來調節內皮舒縮功能[16]。 在動脈粥樣硬化大鼠、肥胖大鼠模型中，經腺病毒介導的Klotho 基因能促進內皮細胞依賴的NO 合成，預防血管中膜肥厚及血管周圍纖維化發生[17]。 最近體外研究發現：分泌型Klotho 擁有調節血管緊張度及刺激NO 產生的能力，而且能抑制血管細胞黏附分子1（VCAM-1）和細胞間黏附分子-1(ICAM-1）產生，通過抑制Pit-1 和Pit-2 阻止高磷酸鹽誘導的血管平滑肌細胞鈣化[12]。

3.3 Klotho 調節FGF23/Klotho 軸，預防血管鈣化 成纖維細胞生長因子23（FGF23）是骨來源的激素樣細胞因子，主要在骨細胞及成骨細胞表達。 研究表明Klotho 基因敲除小鼠，表現出高FGF23 血癥、高磷酸鹽血癥及血管鈣化癥狀，其中高磷酸鹽癥是血管鈣化的獨立危險因素[18]。 臨床試驗表明，與正常組比較，心臟移植組FGF23/Klotho 軸失調與心血管及腎功能惡化密切相關，FGF23 被認為是左心室肥厚及主動脈鈣化的獨立危險因素，可作為不良心血管事件的預測指標[19]。

3.4 Klotho 調節Ca2+通道， 維持內皮完整性 血循環中的Klotho 能維持血管內皮完整性，保護血管通透性。 Ca2+通道能調節血管內皮細胞NO 的合成及釋放、 通透性、增殖、 遷移及凋亡， 鈣通道瞬時受體電位家族成員TRPC-1通道能促進血管內皮生長因子(VEGF) 介導的Ca2+內流。Klotho 維持內皮完整性是通過綁定TPRC-1 和VEGFR-2，增強兩者親和力，促進其共同內化作用，從而降低細胞表面TRPC-1 表達， 限制Ca2+內流入細胞而降低血管內皮通透性及保護內皮完整性[20]。

4 Klotho 與心肌重構

左心室肥厚是慢性腎臟疾病（CKD）患者最重要病變特征， 也是導致死亡的獨立危險因素。 臨床調查86 例CKD 患者發現， 血清Klotho 蛋白與尿毒癥溶質硫酸吲哚酚（IS）表達水平呈負相關，而且兩者都與左心室肥厚有密切關聯。 體內實驗發現，連續腹腔注射IS 正常小鼠，其左心室肥厚與腎臟Klotho 持續下降有關， 在雜合子小鼠中這種變化更加明顯。 體外實驗發現，Klotho 能通過抑制p38 及細胞外信號調節激酶1/2 及抗氧化機制， 顯著抑制IS 誘導的心肌細胞肥大。 這些證據表明Klotho 是IS 誘導的左心室肥厚的保護因子[21]。

Klotho 蛋白的表達水平隨著增齡而下降，循環中分泌型Klotho 表達的下降可能與衰老型心肌病有關。 衰老的心臟對應激誘導的心力衰竭更敏感。 研究發現，在基線水平Klotho 基因缺失的小鼠與野生型小鼠的心臟無明顯異常。 但在應激條件下，Klotho 基因缺失可能發展成更嚴重的病理性心肌肥厚及重構。 Xie 等研究發現，注射異丙腎上腺素加劇了Klotho 基因缺陷小鼠心肌病理性重構的發生，心肌表達更多致命性基因如腦鈉肽、尿鈉肽、β- 蛋白重鏈。 Klotho 蛋白對應激下的心臟保護作用并不通過改變血漿磷酸鹽及FGF23 水平， 而是通過抑制瞬時受體電位-6 經典通道（TRPC-6)而發揮保護小鼠心臟的作用。 將Klotho 基因敲除的小鼠TRPC-6 阻滯后， 并未引起心肌肥大及重構放大效應， 表明Klotho 介導的心臟保護作用是通過下調TPRC-6 的表達而實現。研究發現，Klotho 蛋白主要通過阻滯胰島素生長因子(IGF1)/磷脂酰肌醇-3- 羥激酶（PI3K）信號通路介導的離子通道胞吐作用，降低細胞膜上TRPC6 的含量發揮心臟保護作用[22]。

內質網是細胞內重要的細胞器， 內質網功能的損傷引起內質網應激， 長期過強的內質網應激誘導內質網相關性細胞凋亡。 許多研究證實，在體內外實驗中，嚴重的內質網應激誘導了心肌細胞凋亡， 心肌細胞凋亡是心臟重構的關鍵環節。 傳統的觀點認為，Klotho 主要通過抑制胰島素生長因子發揮抗氧化應激，進而抑制細胞凋亡。 最近Shuan 等[23]研究發現，Klotho 蛋白能抑制內質網應激介導的CHOP 凋亡信號發揮作用， 通過對P38 和JNK 信號通路調控作用，抑制P38 和JNK 磷酸化過程， 進而阻滯了心臟病理性發展，如間質纖維化、心肌細胞肥大。 因此，Klotho 蛋白改善心臟重構可能部分通過抑制內質網應激和改善氧化應激而實現。

5 展望

Klotho 基因是在哺乳動物中最早發現的抗衰老基因。可通過不同途徑發揮調節一氧化氮的生成、 抗氧化應激、調節鈣磷代謝、抗炎癥以及抑癌等作用。 許多動物實驗及臨床試驗證明，Klotho 基因及其表達產物與心血管疾病發生、發展有密切聯系，但其抑制心血管疾病發病的具體機制還不完全清楚，需進一步探討并為心血管疾病治療及診斷不斷提出新的方法。

[1] Kuro M, M atsumura Y,Aizawa H, et al.Mutation of the mouse Klotho gene leads to a syndrom resembling ageing [J]. Nature,1997,390(6655)：45-51.

[2] Richard D, Semba MD, Anne R, et al. Plasma klotho and cardiovascular disease in adults [J]. Am Geriatr Soc,2011,59(9)：1596-1601.

[3] Zhou L, Li Y, Zhou D, et al, Loss of Klotho contributes to kidney injury by derepression of Wnt/b-catenin signaling [J]. J Am Soc Nephrol ,2013,24： 771-785.

[4] Lim K, Lu TS, Molostvov G, et al. Vascular klotho deciency potentiates the development of human artery calcication and mediates resistance to FGF-23[J]. Circulation, 2012,125：2243-2255.

[5] Urakawa I, Yamazaki Y, Shimada T, et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23[J].Nature,2006,444(7120)：770-774.

[6] Chen TH, Kuro-O M, Chen CH, et al. The secreted klotho protein restores phosphate retention and suppresses accelerated aging in Klotho mutant mice[J]. Eur Pharmacol,2013, 698：67-73.

[7] Hu MC, Kuro-OM, Moe OW. Renal and extrarenal actions of klotho[J]. Semin Nephrol, 2013,33(2)：118-129.

[8] Ljm K, Lu TS, Molostvov G, et al.Vascular Klotho deficiency potentiates the development of human artery calcification and mediates resistance to fibroblast growth factor 23 clinical perspective[J]. Circulation, 2012,125：243-255.

[9] Xiao NM, Zhang YM, Zheng Q, et al.Klotho is a serum factor related to human aging[J]. Chin Med J (Engl), 2004, 117(5)：742-747.

[10] Juan F Navarro-González, Javier Donate-Correa, Mercedes Muros de Fuentes, et al. Reduced Klotho is associated with the presence and severity of coronary artery disease[J]. Heart,2014,100(1)：34-40.

[11] Cai H, Lu R, Zhang M, et al. serum Souble klotho is associated with abdominal aortic calcification in patients on maintenance hemidialysis[J]. Blood Purif,2015, 40(2)：120-126.

[12] Ewa Lewin, Klaus Olgaard. The vascular secret of Klotho[J].Kidney International, 2015, 87：1089-1091.

[13] Ikushima M, Rakugih I, Shikawa K, et al.Anti-apoptotic and anti-senescence effects of klotho on vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006, 339：827-832.

[14] Yang K, Nie L, Huang Y, et al. Amelioration of uremic toxin indoxyl sulfate-induced endothelial cells dysfuction by klotho protein[J]. Toxicol Lett,2012, 215：77-83.

[15] M Sopjani, M Rinnerthaler, J Kruja, et al. Intracellular signaling of the aging suppressor protein Klotho[J]. Current Molecular Medicine, 2015, 15 ：27-37.

[16] Nakamura T, Saito Y, Ohyama Y, et al. Production of nitric oxide, but not prostacyclin, is reduced in klotho mice[J]. Jpn J Pharmacol,2002, 89：149-156.

[17] Six I, Okazaki H, Gross P, et al. Direct, acute effects of Klotho and FGF23 on vascular smooth muscle and endothelium[J]. PLoS One,2014, 9： 923-934.

[18] Mitani H, Ishizaka N, Aizawa T, et al. In vivo klotho gene transfer ameliorates angiotensin-Ⅱinduced renal damage[J].Hypertension,2002, 39(4)：838-843.

[19] Przybylowski P, Wasilewski G, Janik L, et al. Fibroblast growth factor 23 and klotho as cardiovascular risk factors in heart transplant recipients[J]. Transplantation Proceedings, 2014, 46：2848-2851.

[20] Kusaba T, Okigaki M, Matui A, et al. Klotho is associated with VEGF receptor-2 and the transient receptor potential canonical-1 Ca2+channel to maintain endothelial integrity[J]. Proc Nat Acad Sci,2010, 107：19308-19313.

[21] Ke Yang,Cheng Wang,Ling Nie, et al. Klotho protects against indoxy sulphate-induced myocardial hypertrophy[J].Am Soc Nephrol,2015,524：1681-1687.

[22] Xie J, Cha SK, An SW, et al. Cardioprotection by Klotho through downregulation of TRPC6 channels in the mouse heart[J].Natural Communication,2012, 3：12-38.

[23] Shuan Song, Pan Gao, Hang Xiao, et al. Klotho suppresses cardiomyocyte apoptosis in mice with stress-induced cardiac injury via downregulation of endoplasmic reticulum stress [J].PLoS ONE, 2013, 812：829-835.