Caveolin-1對下肢缺血再灌注損傷的影響及其機制

李 明綜述，熊國祚審校

（南華大學附屬第二醫院血管外科，湖南衡陽421001）

Caveolin-1對下肢缺血再灌注損傷的影響及其機制

李 明綜述，熊國祚審校

（南華大學附屬第二醫院血管外科，湖南衡陽421001）

細胞質膜微囊蛋白； 再灌注損傷； 腿/血液供給； 缺血； 綜述

下肢缺血再灌注損傷是血管外科常見的病理變化，是由于血管阻塞后重新恢復血運后導致的機體組織、細胞生理和生化改變。Sewell等于1955年發現，在結扎犬冠狀動脈后，心肌缺血后再恢復血流可以導致心肌損傷進一步加重。心肌缺血-再灌注損傷這一概念于1960年首次被Jennings提出，此后缺血再灌注損傷的研究受到了廣大學者的關注。下肢動脈硬化閉塞、急慢性動脈栓塞再通、止血帶長期應用、斷肢再植[1]、嚴重擠壓傷、車禍、戰爭等均可導致肢體缺血，恢復血運后肢體損害有時反而加重[2]，最終可能導致遠隔器官的損傷，造成多器官功能衰竭（MODS）。因此，對于肢體缺血再灌注損傷的發生機制的了解，也是外科醫生需要解決的問題，可以從根本上防治和緩解肢體缺血再灌注損傷。細胞窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）是相對分子質量為（21～24）× 103的膜蛋白，是小窩（Caveolae）的主要結構成分，參與細胞黏附、分子運輸和信號傳導等過程，近年來發現，其與炎性反應、氧化應激、鈣通道開放及細胞凋亡等密切相關。本文介紹Cav-1的結構和功能，重點綜述Cav-1對肢體缺血再灌注損傷的影響及其相關機制，為研究Cav-1在預防和緩解肢體缺血再灌注損傷中的作用及其機制提供新的思路。

1 下肢缺血再灌注損傷的機制

下肢缺血再灌注損傷包括缺血期、灌注期和再缺血期3個過程，目前研究表明，缺血再灌注損傷的發生機制主要是氧自由基產生、鈣超載、炎癥細胞活化、NO的作用、無復流現象、細胞凋亡等。損傷包括缺血性和再灌注性損傷兩方面。缺血性損傷主要包括細胞內外電解質失衡、代謝紊亂、ATP減少、細胞水腫、次黃嘌呤增多及毒性物質增多等因素造成，再灌注損傷主要包括氧自由基增多、鈣超載、中性粒細胞活化、細胞凋亡、核因子-κB（NF-κB）活化等作用，血流恢復后又將炎癥介質及毒性物質帶到遠隔器官造成多器官功能損傷。

2 Caveolae及Cav-1 概述

Caveolae是細胞質質膜微區形態定義為50～100nm的“Ω”形的內陷結構[3]，是生物膜上富含膽固醇和鞘糖脂的脂筏（lipid rafts）樣結構，在終末分化的細胞類型是最豐富的，如內皮細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞、脂肪細胞、Ⅰ型肺泡細胞和成纖維細胞等細胞中含量豐富[4]，主要由Caveolin蛋白、膽固醇、糖脂及多種糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白等組成，而Caveolin蛋白是這種膜結構的殘余主蛋白[5]。Caveolin蛋白家族包括Cav-1、Cav-2和Cav-3，其基因編碼具有同源性，Cav-1又分為α、β 2個亞型。

Cav-1是Caveolae表面主要的鑲嵌蛋白，是細胞質膜微囊結構，也是Caveolae的信號傳遞蛋白和標記蛋白，作為一個腳手架蛋白與多種信號分子相互作用的蛋白，直接將具體的小窩跨膜信號進行傳導的信號蛋白[6]。Cav-1作為一種細胞膜相互作用的結構核心相關蛋白，能誘導多種信號蛋白的活化或沉默，包括G-蛋白、Src激酶、表皮生長因子受體、絲裂原活化蛋白激酶和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）等[7]。研究發現，Cav-1在細胞信號傳導、脂質穩態、炎癥、腫瘤抑制、促進血管張力、鈣通道調控和血壓的調節中發揮關鍵作用[8]。目前研究發現，Cav-1與eNOS的調控有一定關系。

3 Cav-1 對肢體缺血再灌注損傷的影響

3.1 Cav-1與氧自由基 Hu等[9]研究報道，Cav-1參與炎性反應是從不同途徑進行的，如通過活化PKC-δ-Rac信號通路來提高中性粒細胞（PMN）中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的活性，NADPH氧化酶氧化活性是通過在PMN膜上著位的改變而變化的，進而調節脂質過氧化物及過氧化物陰離子的產生。在缺血再灌注損傷的病理生理過程中，NADPH氧化酶起著關鍵性的作用。該酶被激活后可以產生大量活性氧簇（ROS）激活細胞信號通路，其催化反應為：NADPH＋2O→NADP+＋H+＋2O2-。過氧根離子（O2-）在超氧化物歧化酶（SOD）作用下生成過氧化氫（H2O2），O2-和H2O2氧化作用較強，對內皮細胞及平滑肌組織造成損傷。然而，核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種轉錄因子，能介導抗應激的細胞保護效應，Cav-1敲除的細胞表現出更高水平的抗氧化酶活性和更能耐氧化應激誘導的細胞毒性，而過表達Cav-1抑制這些酶的誘導和進一步加速氧化的細胞死亡[10]，Cav-1負性調控Nrf2的活性促進氧化應激的發生。

Cav-1是細胞外調節蛋白激酶（ERK1/2）的負性調節蛋白，內皮細胞中高表達Cav-1，細胞將停留在G0/G1期，使細胞增殖受到抑制。周孝錢等[11]在體外實驗中發現，0.5 mmol/L的H2O2可導致Cav-1表達增高，而正常組合成期細胞數比過氧化氫組明顯增多。Cav-1基因敲除小鼠更能耐受高氧誘導的急性肺損傷[12-15]，可能是部分增強自身抗氧化能力的作用。在下肢缺血再灌注損傷中，氧自由基增多可以促進Cav-1的高表達，抑制細胞增殖，而高表達的Cav-1反過來又可激活NADPH氧化酶加重損傷。

3.2 Cav-1與炎性介質 Cav-1存在于多種細胞中，目前研究發現，Cav-1能激活多條信號通路來參與炎性反應，也調控著炎癥細胞的應答。動物實驗及體外實驗均表明，Cav-1可以刺激炎癥表達及應答等。目前研究發現，Cav-1過表達加重脂多糖（LPS）誘導的細胞損傷，這涉及P38蛋白激酶（P38MAPK）及血管緊張素-1（AT-1）信號途徑，Cav-1的確能調控PMN表面及胞內信號通路的激活[16]。Cav-1活化PMN產生大量炎性介質導致組織細胞損傷，在下肢缺血再灌注中對內皮細胞及血管通透性改變起到一定作用。體外實驗表明，如果破壞Cav-1結構將會導致乙酸肉豆蔻佛波酯（PMA）和趨化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸（fMLP）誘導的PMN產生過氧化物陰離子明顯減少[9]。Cav-1的磷酸化促進TLR4（Toll樣受體4）和髓樣分化因子88（MyD88）的相互作用，導致NF-κB的激活并刺激LPS釋放炎癥介質[17]，并參與內皮細胞黏附。cav-1基因將更能耐受LPS引起的炎癥性肺損傷，換而言之，Cav-1蛋白促進了小鼠肺部炎癥的發生。

在機械性通氣肺損傷的研究中，發現Cav-1是通過激活P38MAPK信號通路使白細胞產生大量白介素-8（IL-8）等炎癥因子[18]。IL-8促使中性粒細胞的著位、黏附、遷移、趨化，并促進腫瘤壞死因子及花生四烯酸等炎癥介質的產生，加重缺血再灌注損傷。有研究表明，cav-1缺乏能抑制LPS刺激的炎性反應[19]，cav-1基因敲除小鼠表現出較少的炎癥肺損傷，與野生型（WT）小鼠相比死亡率降低。因此可以得出結論，Cav-1-P38MAPK-中性粒細胞活化，釋放大量炎癥介質和細胞因子而加重缺血再灌注損傷，Cav-1在激活PMN、NADPH氧化酶的活化及氧自由基等炎癥介質的釋放過程中扮演重要角色。

3.3 Cav-1與NO 目前，學者們對于NO在缺血再灌注損傷中的作用持有不同觀點。NO是機體內細胞信號通路的信號分子，在缺血再灌注損傷中具有促進或抑制作用。但Shiva等[20]研究認為，NO主要通過抑制活性氧形成引起蛋白巰基亞硝化及活化可溶性鳥苷酸活化酶等途徑發揮保護作用。Liu等[21]研究認為，過量NO通過與超氧化物作用形成過氧化亞硝酸鹽，引起酪氨酸硝化和有害蛋白變化；還可通過與亞鐵原卟啉基團中鐵原子形成的亞硝酰鐵結合抑制部分呼吸酶及DNA合成酶活性等途徑對機體造成損害。然而，Cav-1能負性調控eNOS的活性，eNOS是內皮細胞合成NO的關鍵酶，Cav-1過表達將抑制NO的產生。相關研究發現，Cavelae上的定向受體可以轉導eNOS合成所需的刺激性信號，而Cav-1可以阻礙Cavelae上的定向受體來減少eNOS合成，同時Cav-1又可以結合在eNOS的鈣調蛋白結合區，從而抑制eNOS的酶活性[21]。高表達的Cav-1在下肢缺血再灌注損傷中抑制NO的產生，而NO可能能緩解缺血再灌注損傷，Cav-1可能在缺血再灌注中發揮著負性調節作用。

3.4 Cav-1與細胞凋亡 肢體缺血再灌注損傷時，氧自由基產生、鈣超載、酸性代謝產物增多及ATP能量障礙等途徑導致線粒體通透轉換孔開放，引起細胞內外離子平衡失調及線粒體解耦聯的發生，最終導致細胞凋亡[22]。細胞凋亡的經典途徑——線粒體途徑與Bcl-2蛋白家族關系最為密切，Bcl-2蛋白是最重要的凋亡蛋白，ERK-1信號通路的激活對于Bcl-2蛋白的調節起著非常重要的作用，ERK激活后使轉錄因子磷酸化以調節基因的表達，誘導細胞進入S期，處于分裂細胞數增多來抑制細胞凋亡。在凋亡過程中，ERK-l與Cav-1蛋白的活性呈負相關，Cav-l蛋白可能是抑制或降低ERK-1蛋白活性，導致ERK細胞信號轉導通路失去正常的協調平衡能力[23]。換而言之，Cav-1能通過負性調控ERK-1信號通路，促進細胞凋亡。Ras/Raf-1和MAPK通路與細胞凋亡也有著密切關系。有研究報道，Cav-1也可抑制EGFR-Ras-Raf-Mahk通路，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖[24]。Cav-1在肢體缺血再灌注損傷中的作用可能是促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，最終可能導致損傷加重。

3.5 Cav-1與鈣離子 鈣超載假說在肢體缺血再灌注損傷中的表現尤為重要，靜息狀態下鈣離子儲存在肌質網及線粒體中，當出現缺血再灌注損傷后，大量鈣離子內流，激活磷脂酶后線粒體結構被破壞，導致ATP生成減少，細胞及組織缺氧，呈無氧呼吸狀態產生大量過氧化陰離子及酸性代謝物，對肢體缺血再灌注損傷造成級聯放大作用。袁碧英等[25]報道，Cav-1和Cav-3對大鼠動脈血管中平滑肌細胞的鈣離子穩態的調控起重要作用。Caveolae能調控L型鈣通道的Ca2+內流及Ca2++ ATP的活性[26]，促進質膜蛋白質和細胞器之間的相互作用。在人類氣道平滑肌細胞中，Cav-1通過誘導炎癥介質增多促進細胞鈣離子內流，從而在氣道炎癥中起重要作用[27]。目前在肢體缺血再灌注損傷中，Cav-1能調節血管痙攣及氣道平滑肌痙攣已有報道。但是Cav-1能否引起鈣離子大量內流，以及Cav-1能否通過鈣離子通道開放對肢體缺血再灌注損傷產生影響，還需進行相關實驗研究。

4 展 望

Cav-1能激活相關信號通路促進炎癥介質釋放、氧化酶活化、細胞凋亡及鈣通道開放對肢體缺血再灌注造成一定損傷，然而，下肢缺血再灌注損傷的病理生理過程是非常復雜的，是否可通過下調Cav-1蛋白的表達來預防和緩解下肢缺血再灌注所帶來的損傷，需要利用動物及臨床試驗進行循證醫學探究，為以后的臨床藥物研究提供新的思路。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.18.023

A

1009-5519（2015）18-2790-03

2015-04-17）

李明（1989-），男，湖南常德人，碩士研究生，主要從事血管外科方向研究；E-mail：904944188@qq.com。

熊國祚（E-mail：55752528@qq.com）。