不同放牧強度下冰草自然居群的遺傳多樣性分析

秀 花

(西藏農牧科學院 草業科學研究所，西藏 拉薩 850009)

不同放牧強度下冰草自然居群的遺傳多樣性分析

秀 花

(西藏農牧科學院 草業科學研究所，西藏 拉薩 850009)

采用ISSR分子標記技術對不同放牧強度下冰草自然居群的遺傳多樣性進行了研究。結果表明，放牧導致冰草部分位點丟失，但整個冰草居群仍表現出豐富的多態性，ISSR檢測的多態性條帶比率為96.46%，居群間的遺傳差異很小，放牧并未使冰草居群產生遺傳分化。由Shannon’s和Nei’多樣性指數檢測的各個引物在4個冰草居群內的遺傳多樣性的大小排列順序為：中度放牧樣地>重度放牧樣地>無放牧樣地>輕度放牧樣地。

冰草居群；ISSR；放牧強度；遺傳多樣性

冰草屬(Agropyron)為禾本科早熟禾亞科大麥族小麥亞族植物。全世界近百種，我國共有15種，主要分布歐亞大陸溫帶、北美大草原、美國、加拿大。在歐亞大陸中，俄國、蒙古、和中國北部最為豐富，是典型草原、荒漠草原和草原地區沙地及西北半農半牧區的常見牧草。

冰草屬于優等牧草，具有抗旱、耐寒、耐堿、耐踐踏、壽命長、分蘗能力強等特性，營養豐富，抽穗期營養價值最高，消化率高，草質柔軟、適口性良好，在冬春飼草缺乏起著重要的作用。是放牧和打草兼用型牧草，并已廣泛馴化栽培作為草地補播草種。

有關冰草遺傳多樣性的研究報道很多，閻貴興[1]發現冰草屬植物不同種間存在核型多型性；云錦鳳等[2]對蒙古冰草B染色體進行了分析；解新民[3]對蒙古冰草遺傳多樣性研究結果表明，蒙古冰草種內居群間及同一居群內的不同個體間存在豐富的多樣性；李景欣等[4]利用根尖壓片法，從細胞水平對來自6個不同居群的冰草的遺傳多樣性進行研究發現，冰草種內居群間存在一定程度的分化和變異，一些北美國家有關冰草的研究，主要側重其生態建設、耐牧性及營養物質的運輸和儲存等。近年來，ISSR分析技術在品種鑒定和種質資源的遺傳多樣性研究中得到廣泛應用，有關冰草不同放牧強度下遺傳多樣性的研究報道較少，試驗應用ISSR分析技術對不同放牧強度下的冰草遺傳多樣性及其分化進行研究，并為探索合理的放牧制度和草地利用方式，防止草原放牧和放牧草原的恢復提供理論基礎，為篩選耐牧基因提供遺傳學信息。

1 材料和方法

在植物生長旺盛期按株采集冰草(Agroptroncristatum)新鮮葉片。株距50 m以上，選擇株叢徑中等、生長正常的植株30株，剪去葉片，用保鮮膜包好放入冰盒帶回實驗室，貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.1 試驗地自然概況

試驗地位于內蒙古自治區赤峰市克什克騰旗達里諾爾國家級自然保護區境內砧子山以東，N 116°381′～116°411′，E 43°251′～43°271′，氣候屬于中溫型大陸性氣候，年平均氣溫為1～2 ℃，≥10 ℃積溫1 300～1 700 ℃，年降水量350～400 mm,無霜期為60～80 d,植物生長期4～9月,土壤類型為暗栗鈣土。

草原群落隨放牧強度的變化，在居民點或家畜飲水點周圍相繼分布的環狀帶上最明顯，即由此向外輻射，沿半徑方向構成草原群落的放牧梯度，因此，在試驗區以居民點為一端，沿草原群落變化的方向設置樣帶。按照放牧草原分級方法，將草地劃分為輕度放牧樣地、中度放牧樣地、重度放牧樣地和無放牧樣地(夏季無放牧的圍封區)。

1.2 DNA的提取與檢測

稱取0.25 g新鮮葉片。采用CTAB法提取每個植株的總DNA，用0.7%的瓊脂糖電泳檢測DNA質量， DNA的純度和濃度通過紫外吸收法測定。

1.3 ISSR反應條件及程序

PCR反應體系的建立主要通過對DNA濃度、引物等條件進行初步的調整，達到了反應條件的優化，確定了ISSR擴增反應總體積為25 μL,反應體系：其中，包括10×buffer 2.5 μL,2.0 mmol/L MgCl22 μL,0.1 mmol/L dNTPs 0.4 μL,0.15 mmol/L ISSR引物1 μL,40 ng基因組DNA,1單位TapDNA聚合酶。以上各種加完后用滅菌三蒸水補齊至25 μL。

擴增在PE9600型PCR儀上進行。擴增程序為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,進行44個循環,最后72 ℃補平5 min,4 ℃停止。擴增產物用2.8%瓊脂糖凝膠(內含溴化乙錠)電泳鑒定，電泳1.5～2.0 h，將凝膠放在自動凝膠成像系統下進行分析。

1.4 引物篩選

以無放牧樣地的冰草DNA為材料，對30個ISSR引物進行篩選，篩選出12個擴增條帶較多、信號強、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應。引物由上海生物工程公司合成(表1)。

表1 ISSR所用引物序列與序號Table1 Primer sequence and serial number adopted ISSR

1.5 擴增產物和差異帶的分析方法

1.5.1 帶的記錄 電泳圖的每一條帶(DNA片段)，均為一個分子標記(Marker)，代表一個引物的結合位點。根據各分子標記的遷移率及其有無統計所有的二元數據；有帶(顯性)記作1，無帶(隱性)記作0，強帶和弱帶的賦值均為1。

1.5.2 數據的統計分析法 應用POPGEN32軟件對冰草種間遺傳結構進行分析，計算Nei基因多樣性指數(H)，Shannon表型信息指數(I)，群體分化系數(Gst)等；根據Nei遺傳距離用類平均聚類方法(UPGMA)進行系統聚類，分析群體間遺傳分化關系。

2 結果與分析

2.1 多態位點比率

表2列出了在4個冰草居群中檢測到的多態位點數及百分率。在無放牧居群中共檢測到105個位點，其中，多態位點82個，占71.93%；在輕度放牧居群中共檢測到93個位點，其中，多態位點69個，占60.53%；中度放牧居群中檢測到106個位點，其中多態位點90個，占78.95%；重度放牧居群中檢測到98個位點，其中多態位點77個，占67.54%。在冰草種內檢測到114個位點，多態位點110個，占96.49%。多態位點在居群內從大到小的分布是中度放牧>無放牧>重度放牧>輕度放牧居群。每一個引物擴增出的DNA帶的數目在2～12，擴增出的DNA帶的大小在300～1 500 bp之間。

表2 4個冰草放牧系列居群的多態位點比較Table2 Polymorphic loci comparison between 4 grazing series populations of Agroptron cristatum

2.2 遺傳多樣性分析

利用Shannon’s指數，根據每個引物在不同居群擴增的ISSR表型結果的差異和出現的頻率不同，計算冰草居群遺傳多樣性并列于表3，由表3可以看出，同一引物在不同居群中估計的遺傳多樣性指數不同；不同引物在同一居群內所估算的數值也不相同。其中，引物36541在中度放牧居群中故測的數值最高為0.608 3，引物31672在輕度放牧居群中故測的最低為0.062 1，Shannon’s指數故測的4個冰草居群內的遺傳多樣性由大到小的順序為中度放牧居群(0.455 5)>重度放牧居群(0.388 9)>無放牧居群(0.382 6)>輕度放牧居群(0.322 6)。

根據表4，引物31669估算的居群內遺傳多樣性(Hpop)最高(0.459 2)，引物31675估算的居群內遺傳多樣性最小，只有0.248 2，12個引物估算的居群內遺傳多樣性平均是0.387 4；對種內總的遺傳多樣性(Hsp)的估算，引物22893估算數值最高0.587 9，引物31 675估算數值最低0.333 8，平均值為0.517 5。

由Shannon’s指數估計的居群內遺傳多樣性在引物31 676中最大為87.73%，引物31674最小為63.23%，居群內遺傳多樣性平均值為74.86%，居群間遺傳多樣性從12.27%(引物31676)到36.77%(引物31674)，居群間遺傳分化的平均值為25.14%。說明放牧干擾對冰草居群的分化程度有所影響，但是，由于不同放牧居群所處的地理自然環境相同，居群之間并未產生隔離，仍存在基因交流，因而沒有哪個居群擁有特有的位點或等位基因。但是，并非所有等位基因在不同居群均有分布，有的位點在不同的居群上有丟失現象。

表3 Shannon’s指數估算的4個冰草居群內的遺傳多樣性Table3 Genetic diversity of 4 Agroptron cristatum populations estimated by Shannon`s index

表4 Shannon’s 多樣性指數估算的居群內、居群間遺傳多樣性及分化Table4 Genetic diversity and differentiation in population and among populations estimated by Shannon`s index

由Nei’s指數估算的各個引物在4個冰草居群內的遺傳多樣性(表5)檢測中，引物36541在中度放牧居群中估測的數值最高為0.419 6，引物31672在輕度放牧居群中估測的數值最低為0.042 1，遺傳多樣性在中度放牧居群最高(0.311 3)，輕度放牧居群最低(0.217 0)，按遺傳多樣性的大小排列各居群順序為：中度放牧居群(0.311 3)>重度放牧居群(0.263 7)>無放牧居群(0.255 8)>輕度放牧居群(0.217 0),這與Shannon’s多樣性指數檢測的遺傳多樣性指數一致。

表5 Nei’s指數估計的4個冰草居群內的遺傳多樣性Table5 Genetic diversity of 4 Agroptron cristatum populations estimated by Nei’s index

2.3 遺傳結構與基因流

植物的基因型在居群內和居群間不隨機分布，在不同居群之間，同一居群的不同亞居群之間，甚至在同一個體的不同后代之間都存在顯著的遺傳差異。根據表6，Nei’s指數計算的冰草種內總遺傳多樣性的平均值為0.348 9，居群內遺傳多樣性平均值為0.261 9，居群間的遺傳分化為21.95%，說明有21.95%的遺傳變異存在于居群之間，78.05%的遺傳變異存在于居群內。不同引物所占的比例不同，其中，引物36543最高為34.47%，引物31667最低為11.80%，各個引物的Nm值差異較大，從11.283 4到1.501 8不等，平均值為4.080 8。

表6 Nei’s指數估算的居群內、居群間遺傳多樣性及分化Table6 Genetic diversity and differentiation in population and among populations estimated by Nei’s index

2.4 遺傳距離與遺傳相似度分析

根據12個引物ISSR擴增產物的電泳結果，按Nei方法計算出4個不同放牧強度冰草居群的遺傳距離和遺傳相似度。輕度放牧居群和重度放牧居群遺傳距離最遠，為0.221 9，遺傳相似度最小0.801 0，這表明兩者之間的遺傳差異最大；中度放牧居群和無放牧居群遺傳距離最近0.118 6；遺傳相似度最高0.888 2，說明這輛個居群的遺傳差異最小(表7)。

表7 4個放牧系列冰草的遺傳相似度及遺傳距離Table7 Genetic similarity and genetic distance between 4 grazing series populations of Agroptron cristatum

注:星號為對角線

圖1是根據遺傳距離所構建的UPGMA聚類圖，圖中無放牧居群和中度放牧居群首先聚為一類，其次，輕度放牧居群和無放牧居群、中度放牧居群聚為一類，最后，重度放牧居群和其他3個居群聚為一類，這說明無放牧居群和中度放牧居群遺傳差異最小，中度放牧居群和其他3個居群的遺傳差異大一些(圖2)。

圖1 不同放牧強度冰草居群ISSR分析的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of Agroptron cristatum population ISSR analysis under different grazing intensities

3 討論

植物居群遺傳變異水平和遺傳結構與其適應性和進化潛力密切相關。個體的遺傳變異、居群的遺傳分化保證了植物對異質環境的適應，利于居群的生存繁衍。

張紅梅[8]在研究未放牧利用的居群和長期放牧后又圍封的居群中發現，放牧壓力使大針茅居群的少數位點缺失、突變，同時有新的位點出現，但居群間的遺傳差異很小，放牧未使大針茅產生遺傳分化。試驗通過ISSR分子標記分析結果也表明不同放牧壓力下，冰草居群的Nei’s指數和Shannon’s指數的估算都顯示出大量的分子變異存在于冰草居群內部，少量存在于居群間，說明不同放牧壓力下的4個居群具有很相似的基因頻率，由于不同放牧居群之間并未產生生境隔離，居群之間仍存在基因交流，因而居群間未產生明顯的分化。但是，并非所有等位基因在不同居群均有分布，有的位點在不同的居群上有丟失現象。ISSR的結果分析中，由Shannon’s多樣性指數估計的各個引物在4個冰草居群內的遺傳多樣性的大小排列順序為：中度放牧樣地>重度放牧樣地>無放牧樣地>輕度放牧樣地,這與Nei’s指數檢測的遺傳多樣性順序一致，這也許說明適度放牧利用對冰草遺傳多樣性有促進作用。

圖2 冰草居群ISSR擴增圖Fig. 2 ISSR amplified map of Agroptron cristatum

注：A.引物W31673在無放牧居群擴增譜帶；B.引物W31673在輕度放牧居群擴增譜帶；C.引物W31673在中度放牧居群擴增譜帶；D.引物W31673在重度放牧居群擴增譜帶

[1] 閻貴興.中國草地飼用植物染色體研究[M].呼和浩特：內蒙古人民出版社，2001.

[2] 云錦鳳，斯琴高娃.蒙古冰草B染色體的研究[J].內蒙古農牧學院學報，1996，17(1)：14-17.

[3] 解新民.蒙古冰草的遺傳多樣性研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2001.

[4] 李景欣，云錦鳳，阿拉坦蘇布道.冰草的遺傳多樣性研究[J].中國草地，2004(6)：12-15.

[5] 解佳燕，張知彬.ISSR標記技術及其在遺傳多樣性研究中的應用[J].獸類學報，2004(1)：71-75.

[6] 邱英雄，傅承新，吳斐捷.明黨參與川明參群體遺傳結構及分子鑒定的ISSR分析[J].中國中藥雜志，2003(7)：598-602.

[7] 李海生.ISSR分子標記技術及其在植物遺傳多樣性分析中的應用[J].生物學通報，2004(2)：19-20.

[8] 張紅梅.大針茅居群遺傳變異的RAPD研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2002.

[9] 韓冰.克氏針茅居群分化及不同放牧系列生態變異的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2003.

[10] 珊丹.放牧壓力下大針茅居群的適應性研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2005.

[11] 林杰君,鮑毅新,劉軍.分子標記及其在動物遺傳結構研究中的應用[J].生態學雜志,2013,31(5)：1319-1326.

[12] 張春平,何平,何俊星. ISSR分子標記對金蕎麥8個野生居群的遺傳多樣性分析[J].中草藥，2010，41(9)：1519-1522.

[13] 朱巖芳,祝水金,李永平. ISSR分子標記技術在植物種質資源研究中的應用[J].種子，2010,29(2)：55-59.

[14] 閆偉紅,徐柱,李臨杭.冰草屬植物ISSR遺傳分析與評價[J].華北農學報，2010,25(2)：60-64.

[15] 劉青松,陳立波,李志勇.不同苜蓿農藝性狀研究及ISSR分子標記分析[J].華北農學報,2014,29(3)：109-114.

[16] 張穎娟,王斯琴花.不同苜蓿種質材料的ISSR分析及遺傳多樣性研究[J].中國草地學報,2014,36(3)：35-39.

[17] 秀花,趙萌莉,韓冰.放牧脅迫下冰草種群遺傳多樣性的研究[J].草原與草業,2014,26(1):30-34.

[18] 鄭海燕,粟建光,戴志剛.利用 ISSR和RAPD標記構建紅麻種質資源分子身份證[J].中國農業科學,2010,43(17)：3499-3510.

[19] 鄢家俊,白史且,張新全.青藏高原東南緣老芒麥自然居群遺傳多樣性的SRAP和SSR分析[J].草業學報,2010,19(4):122-134.

[20] 郭紅媛,賈舉慶,呂晉慧.燕麥屬種質資源遺傳多樣性及遺傳演化關系ISSR分析[J].草地學報,2014,22(2):344-351.

[21] 郭郁頻,任永霞,張穎超.早熟禾種質資源ISSR遺傳多樣性分析[J].中國草地學報,2014,36(3):28-34 .

[22] 陳云,閆偉紅,吳昊.干旱脅迫下老芒麥遺傳多樣性分析[J].草原與草坪,2014(2):13-19.

[23] 閆偉紅,徐柱,李臨杭,等.冰草屬植物醇溶蛋白遺傳分析與評價[J].草原與草坪,2010(1):3-8.

[24] 李志勇,孫啟忠,李鴻雁,等.分子標記技術在牧草種質資源研究中的應用[J].草原與草坪,2010(10):93-98.

Study on ISSR ofAgroptroncristatumat different grazing gradients

Xiuhua

(InstituteofPrataculturalScience,TibetAcademyofAgricultureandAnimalHusandryScience,Lhasa850009,China)

The genetic diversity ofAgropyroncristatumunder different grazing intensity was studied with ISSR molecular marker technology. The results showed that although some polymorphic loci were missed due to grazing, the whole wheatgrass population still exhibited the rich polymorphism. Polymorphicbands ratio detected with ISSR was 96.46%, the genetic differences among populations was small, grazing did not produce genetic differentiation. Genetic diversity of each prime in 4 wheatgrass populations estimated by Shannon’s and Nei’s diversity index was: moderate grazing>severe grazing>banning grazing>light grazing.

Agropyroncristatum; ISSR;grazing;genetic diversity

2014-11-29；

2015-01-05

西藏牧區“生產、生態、生活”保障技術集成與示范項目(2012BAD13B04)資助

秀花(1977-)，女，內蒙古人，助理研究員，碩士，從事草地生態和管理工作。 E-mail：xiuhua621@163.com

Q 786

A

1009-5500(2015)01-0009-07