miR-1976在細菌性陰道病中的作用及其機制

馬致南, 徐　揚, 鄔姝陽, 曾　新, 李　萍

(1. 江蘇省揚州市婦幼保健院 婦產科, 江蘇 揚州, 225000;

江蘇省2. 南京市玄武區婦幼保健所 婦科 江蘇 南京, 210029;

3. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦幼醫學研究中心, 江蘇 南京, 210004;

4. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦科 內分泌科, 江蘇 南京, 210004)

miR-1976在細菌性陰道病中的作用及其機制

馬致南1, 徐揚1, 鄔姝陽2, 曾新3, 李萍4

(1. 江蘇省揚州市婦幼保健院 婦產科, 江蘇 揚州, 225000;

江蘇省2. 南京市玄武區婦幼保健所 婦科 江蘇 南京, 210029;

3. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦幼醫學研究中心, 江蘇 南京, 210004;

4. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦科 內分泌科, 江蘇 南京, 210004)

摘要:目的闡述miR-1976及CD105, 整合素αvβ6的關系,探討三者在陰道感染中的作用及機制。方法采用Real-Time PCR方法檢測健康及細菌性陰道病患者陰道黏膜組織中miR-1976與CD105、整合素αvβ6的表達；評估陰道上皮細胞系VK2/E6E7過表達miR-1976后其CD105, 整合素αvβ6的表達情況；闡述過表達miR-1976對VK2/E6E7細胞增殖和凋亡的影響。結果細菌性陰道病患者陰道黏膜組織中miR-1976顯著低表達，而CD105, 整合素αvβ6的mRNA顯著高表達(P<0.05); VK2/E6E7細胞過表達miR-1976后，其增殖和凋亡未受明顯影響，而CD105和整合素 αvβ6的mRNA則顯著低表達(P<0.05)。結論miR-1976通過CD105調節整合素αvβ6的表達，從而影響陰道上皮細胞的黏附能力，參與細菌性陰道病的發生。

關鍵詞:細菌性陰道病; miR-1976; CD105; 整合素αvβ6

病原微生物定植于陰道黏膜表面是陰道炎發生的第一步。當發生病原微生物入侵時，陰道黏膜上皮細胞迅速脫落(剝離)，以保護機體免受感染；但大多數病原微生物可通過改變陰道黏膜上皮細胞的黏著能力，阻斷細胞的遷移與脫落，從而定植于陰道黏膜，破壞其防御，導致陰道炎。治療陰道炎，從陰道黏膜本身的防御功能及機制出發，尋找新的治療靶標，有可能改變目前陰道炎治療效果不佳的現狀[1-3]。

整合素是細胞表面黏附分子家族成員之一，介導細胞間及細胞與細胞外基質(ECM)的黏附反應及信號傳遞，調節細胞的各種生物學行為，對細胞黏附、生存、生長、增殖、凋亡起主要調節作用[4]。其中，整合素的亞型αvβ6在腸道黏膜的感染與防御中具有重要的調控作用[5-6], 考慮到不同部位的黏膜具有相似特性，因此整合素家族成員αvβ6也可能是參與了陰道黏膜感染與防御的關鍵分子。

本研究檢測了細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中miR-1976與CD105、整合素αvβ6的表達情況，并檢測了miR-1976在陰道上皮細胞VK2/E6E7中過表達后對其增殖和凋亡的影響以及對CD105與整合素αvβ6表達的影響，以期闡述miR-1976與CD105、整合素 αvβ6在陰道感染中的關系、作用及機制。

1資料與方法

1.1　標本收集和處理

收集2013年9月—2014年5月由于子宮良性腫瘤在本院行全子宮切除術的健康與細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織各30 例，術中黏膜組織離體后以4 ℃無菌PBS緩沖液沖洗后迅速置入液氮，保存待用。

1.2　材料來源

人陰道上皮細胞系VK2/E6E7購于美國模式培養物集存庫(ATCC); K-SFM培養基(美國Gibco); miR-1976慢病毒過表達載體(上海吉凱); Trizol(美國Invitrogen); Real-Time PCR試劑盒(美國Thermo); PR-7-AAD凋亡試劑盒(美國BD)；未提及試劑均購自美國Gibco公司。

1.3　方法

1.3.1Real-Time PCR:檢測健康女性與細菌性陰道病女性陰道黏膜中miR-1976, CD105、整合素 αvβ6的mRNA表達。按Trizol說明書提取組織總RNA，經紫外分光光度法定量后，應用實時熒光定量(RT-PCR)法檢測細胞中CD105、整合素β6亞基、內參GAPDH基因mRNA表達水平。β6亞基上游引物序列: 5′-GAAGGAATGATCACGTACAAGGT-3′, 下游引物序列: 5′-AGCAGGCAGTCTTCACAGGT-3′; GAPDH基因上游引物序列: 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′, 下游引物序列: 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。實時熒光定量RT-PCR采用Taqman探針法，反應體系20 μL: 熒光定量探針反應預混液10 μL, 探針和引物預混液1 μL, 模板cDNA 1 μL, 水8 μL。cDNA模板擴增反應條件: 95 ℃ 10 min變性; 95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40個循環。RT-PCR每次實驗設3個復孔，實驗重復3次。

1.3.2細胞培養: VK2/E6E7細胞復蘇后培養于K-SFM培養基，置于37 ℃、含5%CO2的培養箱中，當細胞貼壁后達到90%融合時，以0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA消化液消化8 min, 倒置顯微鏡下觀察見細胞形態變圓漂浮后，加入含10% FBS的DMEM/F-12培養基，吸取細胞懸液至10 mL離心管, 1 000 r/min離心10 min, 棄上清, 1∶3轉移細胞至25 cm培養瓶繼續培養，每2～3 d傳代1次。

1.3.3慢病毒轉染: 克隆人miR-1976所在區域500 bp左右的基因組序列(minigene), 構建慢病毒過表達載體(GFP作為 marker); 以只含GFP的慢病毒載體為對照，包被成慢病毒顆粒，感染VK2/E6E7細胞; 72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白表達，判斷病毒感染效率。經預實驗后確定感染復數(MOI)=10, 將3×105個細胞接種至25 cm小瓶中(融合度約30%), 貼壁后加入miR-1976過表達慢病毒約12 μL(濃度為1×109TU/mL), 同時加入polybrene 3 μL(20 mg/mL)以增強轉染效率；在37 ℃含5% CO2培養箱中培養12 h后更換新鮮培養基。轉染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白表達以判定轉染效果；采用Real-Time PCR技術驗證細胞內成熟miR-1976是否過表達。同法轉染只含GFP的空白載體病毒。

1.4　MTT 法檢測細胞增殖

轉染miR-1976過表達慢病毒載體72 h后，將VK2/E6E7細胞以4 000個/孔置入96孔板中，同時設置陰性對照和空白對照組，每組設6個平行孔，繼續培養0、24、48、72 h，于每孔加入濃度為5 μg/mL的MTT溶液10 μL, 繼續培養4 h, 棄上清，每孔加100 μL DMSO溶液終止反應，搖床震蕩10 min, 在酶標儀上測出每孔490 nm波長的吸光度值，繪制細胞增殖曲線。實驗重復3次。

1.5　PE-7AAD雙標記法檢測細胞凋亡

細胞轉染miR-1976過表達慢病毒載體培養72 h后收獲細胞, PBS洗滌2次，重懸于100 μL 1×Binding Buffer, 混勻，加入5 μL PE和5 μL 7-AAD, 室溫避光反應15 min; 300 g、4℃離心5 min, 棄上清，加400 μL 1×Binding Buffer, 混勻。1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡率。設置空白對照組及陰性對照組。實驗重復3次。

Real-Time PCR法檢測CD105與整合素αvβ6在過表達miR-1976的VK2/E6E7細胞與其對照組細胞中的表達情況。方法同前。

2結果

2.1　miR-1976、CD105及整合素αvβ6在細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中的表達

表達三PCR: glycumtance ogy, Nan Nanjing, Nanjing, Jiangsu, Real-Time PCR檢測健康與細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織各30例，細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中miR-1976表達下調6.3倍，差異有統計學意義(P<0.05), 表明細菌性陰道病女性陰道黏膜中miR-1976明顯下調(圖1A)。Real-Time PCR檢測健康與細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織，可見CD105在細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中表達增高3.1倍，整合素αvβ6在細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中表達增高2.4倍，差異有統計學意義(P<0.05), 表明CD105、整合素αvβ6在細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織中顯著高表達(圖1 B、1C)。

A. miR-1976在細菌性陰道病組低表達

B. CD105在細菌性陰道病組高表達

C. 整合素αvβ6在細菌性陰道病組高表達

圖1miR-1976與CD105、整合素αvβ6在

細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中的表達

2.2　過表達miR-1976對VK2/E6E7細胞中miR-1976與CD105、整合素αvβ6表達的影響

熒光顯微鏡結果如圖2B示，綠色熒光為GFP表達，可見轉染陽性率>80%，慢病毒轉染成功。

2.3　Real-Time PCR及MTT結果

VK2/E6E7細胞中miR-1976表達增高(約5.5倍)(圖3 A); MTT結果示慢病毒轉染后，過表達miR-1976細胞與空載慢病毒細胞均于細胞培養約36 h達增殖平臺期，慢病毒載體對細胞增殖能力無明顯影響(圖3B)。

2.4　細胞凋亡

慢病毒轉染VK2/E6E7細胞后，細胞凋亡率明顯增加，未轉染細胞凋亡率為1%，而轉染空載慢病毒載體的細胞凋亡率為60.2%; 但轉染過表達miR-1976慢病毒載體的細胞凋亡率較空載慢病毒凋亡率低，僅為32.5%, 差異有統計學意義(P<0.05), 表明miR-1976過表達后慢病毒載體對VK2/E6E7細胞凋亡有明顯影響，而miR-1976過表達則對其凋亡無明顯影響(圖4)。

A. 攝于白光

B. 攝于綠光

A. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

B. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

細胞后對其增殖的影響情況

圖3miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7細胞

2.5　miR-1976過表達的VK2/E6E7細胞中CD105及整合素αvβ6的表達

miR-1976過表達的VK2/E6E7細胞中CD105表達下調2.3倍，整合素αvβ6表達下調2.1倍，差異有統計學意義(P<0.05), 表明VK2/E6E7細胞中過表達miR-1976后CD105及整合素αvβ6表達明顯下調(圖5)。

A. 為對照組細胞的凋亡情況; B. 為空載慢病毒載體對細胞凋亡的影響; C. 為miR-1976過表達對細胞凋亡的影響。

圖4過表達miR-1976對VK2/E6E7細胞凋亡的影響

3討論

越來越多的研究[7]顯示，具有調控功能的非編碼RNA-miRNAs是有潛力的生物標志物，其大小20～25個核苷酸。成熟的miRNA在RNA誘導沉默復合物(RISC)引導下在轉錄后對靶基因mRNA的表達實施調控。在哺乳動物中，多數情況是與部分互補mRNA的3′-UTR區片段完全或不完全配對，降解靶mRNA或阻遏其轉錄后蛋白質的翻譯，即負向調控基因表達。microRNA

圖5 miR1976過表達對CD105與整合素αvβ6表達的影響

在人類多種疾病中發揮調控作用，可以作為潛在的診斷標志、預后標志及治療靶標[8]。本實驗發現miR-1976在細菌性陰道病患者陰道黏膜組織中的表達明顯下調，同時CD105及整合素αvβ6的表達明顯上升; miR-1976過表達慢病毒載體不影響VK2/E6E7細胞的增殖和凋亡，但其過表達后陰道上皮細胞VK2/E6E7中CD105及整合素αvβ6表達明顯下調。這一結果提示miR-1976可能通過調節 CD105的表達進而調節整合素αvβ6的表達，從而影響陰道上皮細胞的黏著能力，進而參與陰道黏膜的感染與防御功能。

CD105是一類比較新的細胞黏附分子，主要與細胞的增殖有關并參與腫瘤血管的生成；細胞表面的αvβ6通過胞外區與其配體結合后，通過胞內區與細胞內骨架蛋白如肌動蛋白、踝蛋白和紐蛋白等相互作用，介導細胞黏附，并將細胞外基質(ECM)所承載的信號經過復雜的通路傳遞至細胞核內，從而影響細胞基因的表達，進而影響細胞的運動、增殖、分化、凋亡[9]。本研究結果證實，細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中整合素αvβ6的表達顯著高于正常女性陰道黏膜組織，提示整合素αvβ6在細菌性陰道病中發揮重要作用。miR-1976在VK2/E6E7細胞過表達后使CD105表達下調、同時使整合素αvβ6的表達下調，提示miR-1976可能在陰道上皮細胞中直接調控CD105、整合素αvβ6。

Muenzner等[10]在Science發表的研究論文證實，陰道中的淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)與黏膜上皮細胞表面的癌胚抗原相關的細胞黏附分子(CEACAMs)結合將引發 CD105的從頭合成, CD105通過激活整合素的內向信號轉導功能使整合素的活性增加，增強受感染的黏膜上皮細胞的黏著能力，避免其遷移與脫落，有利于淋病奈瑟菌的定植及感染。這與本研究結果具有一致性。分析細菌性陰道病發病機制可能為miR-1976低表達，解除了對靶基因CD105的抑制作用, CD105從頭合成增加，增強整合素αvβ6的活性，使陰道壁上皮細胞的黏附能力增強，脫落減少，有利于致病菌定植于陰道壁上皮細胞并感染細胞，從而導致細菌性陰道病的發生。

本研究通過比較miR-1976過表達前后VK2/E6E7細胞中CD105和整合素αvβ6表達水平的變化，發現miR-1976過表達可以下調CD105和整合素αvβ6的表達，這將有助于闡明 miR-1976 在陰道上皮細胞中的生物學功能及其參與陰道黏膜感染與防御功能的分子機制，提示miR-1976可能成為一個新的極具前景的陰道炎治療的靶點。

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Function and mechanism of miR-1976 in bacterial vaginosis

MA Zhinan1, XU Yang1, WU Shuyang2,

ZENG Xin3, LI Ping4

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,YangzhouMaternalandChildHealthCare

Hospital,Yangzhou,Jiangsu, 225000; 2.DepartmentofGynecology,Maternaland

ChildHealthCareCenterofXuanwuDistrictinNanjing,Nanjing,Jiangsu, 210029;

3.TheResearchCenterofMaternalandChildMedicine,NanjingMaternal

andChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004; 4.Departmentof

Gynecology,NanjingMaternalandChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo clarify the relationship among miR-1976, CD105and integrin αvβ6 and to evaluate the function and mechanism of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa infection.MethodsThe expression levels of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa of healthy women and vaginitis ones were detected by real-time PCR, and the expression levels of CD105and integrin αvβ6 in VK2/E6E7 cell lines were investigated under the circumstance of miR-1976 over-expressed. Meanwhile, flow cytometry was used to evaluate the influence of lentivirus on cell proliferation and apoptosis.ResultsThe expression of miR-1976 was significantly lower in vaginitis mucosa than in healthy ones(P<0.05), and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much higher reversely(P<0.05). After miR-1976 was over-expressed in VK2/E6E7 cell lines, the cell proliferation and apoptosis were scarcely impacted by the lentivirus, and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much lower than before(P<0.05). ConclusionIt has been verified that miR-1976 can regulate the expression of integrin αvβ6 through CD105, and miR-1976 also participate in vaginal mucosa infection through influencing the adhesion ability of vaginal mucosa cells.

KEYWORDS:bacterial vaginal disease; miR-1976；CD105; integrin αvβ6

通信作者:李萍, E-mail:liping0099@126.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81370679); 江蘇省揚州市科技計劃項目(2014189)

收稿日期:2014-12-20

中圖分類號:R 711.73

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-006-05DOI: 10.7619/jcmp.201507002