小鼠Stra8基因慢病毒表達載體的構建與鑒定

鄭　哲, 鄭　英

(揚州大學醫學院, 1. 組織學與胚胎學教研室; 2. 臨床醫學系, 江蘇 揚州, 225001)

小鼠Stra8基因慢病毒表達載體的構建與鑒定

鄭哲1,2, 鄭英1

(揚州大學醫學院, 1. 組織學與胚胎學教研室; 2. 臨床醫學系, 江蘇 揚州, 225001)

摘要:目的探討GV341質粒構建小鼠Stra8基因的慢病毒表達載體的方法。方法應用PCR技術擴增目的基因，將擴增產物插入慢病毒質粒GV341, 通過PCR篩選及測序對陽性克隆進行鑒定。將慢病毒表達載體轉染至293T細胞后，提取轉染細胞的總蛋白，用Western Blot法檢測細胞中Stra8蛋白的表達情況。結果 成功構建了GV341-Stra8慢病毒表達載體。結論Stra8慢病毒表達載體的構建為體外研究Stra8基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞:小鼠Stra8基因; 慢病毒載體; 293T細胞

Stra8是一種受視黃酸(RA)調控的基因，是哺乳動物生殖細胞由有絲分裂轉變為減數分裂前特異表達的基因[1]。研究[2]表明，Stra8是胚胎和出生后性腺中特異性表達的基因，同時其在生殖細胞的細胞質和細胞核內均有表達，且當細胞處于不同功能狀態時，Stra8可在細胞質和細胞核之間進行穿梭，從而發揮不同的功能。Stra8基因敲除小鼠雄性不育，出現與減數分裂細胞周期、染色質濃縮、基因同源重組、DNA損傷修復及細胞凋亡相關的異常表型[3]。據報道[4]，Stra8的一個單核苷酸多態性的遺傳變異可能與中國男性原發性無精子癥和嚴重少精子癥有相關性。Stra8在人類及小鼠的精子發生的過程中都是必不可少的，但Stra8在精子發生中的分子調控網絡尚未闡明。本研究構建了Stra8慢病毒表達載體，通過轉染293T細胞后發現，在轉染的細胞中能夠特異性高表達Stra8蛋白。該載體構建后，作者將應用慢病毒表達系統包裝慢病毒，感染小鼠精原細胞株，構建具有穩定表達Stra8蛋白的生精細胞系，為體外研究Stra8的分子調控機制提供模型。

1材料與方法

1.1　材料與試劑

GV341載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，293T細胞由揚州大學醫學院生物化學教研室程宏博士惠贈, DNA分子量標準、dNTP、Age I、BamH I及T4連接酶購自Takara公司, Taq polymerase 購自上海生工生物有限公司，引物由華大基因生物公司合成，質粒抽提試劑盒購自Axygen公司，脂質體lipofectamine2000購自Invitrogen公司, DMEM、胰酶及胎牛血清購自Gibco公司, Flag鼠抗購自Sigma公司，辣根酶標記山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司, GAPDH兔多克隆抗體購自Santa cruz公司, Plus-20離心超濾裝置購自Millipore公司, ECL發光試劑盒購自北京普利來基因技術有限公司。

江蘇省創新創業訓練計劃項目(201311117094X); 揚州大學大學生實踐創新訓練計劃項目

1.2　實驗方法

1.2.1Stra8片段的擴增：以pCR-Blunt-Stra8質粒為模板進行Stra8編碼閱讀框區域的擴增，上游擴增引物為: 5′-CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGCCACCCCTGGAGAAGG-3′; 下游擴增引物為: 5′-AATGCCAACTCTGAGCTTCAGATCGTCAAAGGTCTCCAG-3′; PCR反應條件為: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 45 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min, 35個循環, 72 ℃ 10 min。反應體系為: 10×Taq Buffer 5 L, 10 mmol/L dNTP 1 L, 10 mol/L上游引物2 L, 10 mol/L下游引物2 L, 10 ng/μL模板2 L, Taq酶1 L, H2O 37 L, 預計PCR產物長度為1182 bp。瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.2GV341-Stra8重組質粒的構建：將上述PCR產物及GV341空載質粒分別用Age I和BamH I進行雙酶切，然后用T4連接酶進行連接，將連接反應產物轉化，利用PCR法對轉化子進行鑒定，篩選出陽性克隆。PCR上游引物為: 5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′; 下游引物為: 5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′; 預計陽性轉化子PCR產物片段為1281 bp, 陰性轉化子PCR產物片段為212 bp。PCR反應條件同上。將經PCR鑒定后的陽性克隆送上海華大基因公司進行測序。

1.2.3慢病毒重組質粒表達的鑒定:將慢病毒重組質粒GV341-Stra8轉染至真核細胞中，觀察其能否在細胞中表達Stra8蛋白。轉染前1 d將293T細胞接種于6孔板中，次日細胞融合度約80%左右。按照Lipofectamine TM2000說明書的要求，將GV341-Stra8表達載體DNA 10 g轉染至293T細胞中，轉染48 h后收集細胞。

1.2.4細胞總蛋白質的提取:收集轉染后的293T細胞，用200 L蛋白裂解液冰上裂解細胞30～60 min, 4 ℃高速離心20 min, 取上清保存備用。

1.2.5Western Blot分析:在細胞總蛋白(約50 μg)中加入等體積2×loading buffer, 將樣品在水中煮5～10 min, 冰上冷卻5～10 min, 13 000 r/min離心15 min后取上清；將樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠(125 g/L)上樣孔，先10 mA恒流電泳30 min, 后用20 mA恒流電泳，直至溴酚藍到達凝膠下緣；將凝膠中的蛋白用電轉膜儀(0.8 mA/cm2)轉移到PVDF膜；將PVDF膜放入含50 g/L脫脂奶粉的TBS中封閉2 h; 加入Flag鼠抗(以1∶3 000稀釋于TBS中), 4 ℃過夜；次日用TBS洗3次, 10 min/次；加入HRP-conjugated goat anti-mouse 二抗(1∶4 000稀釋), 37 ℃, 1 h; TBS洗3次, 10 min/次；用增強化學發光反應(ECL kit, Amersham Bioscience)顯色，化學發光凝膠成像系統中檢測雜交信號。

2結果

2.1　慢病毒重組質粒GV341-Stra8的構建

應用前述引物，以質粒pCR-Blunt-Stra8為模板進行擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳觀察, PCR產物大小在1 200 bp左右，與預計片段長度相一致(圖1)。將PCR產物與線性慢病毒載體GV341連接后，應用PCR擴增，獲得含插入片段的陽性克隆(圖2)，經序列測定后，證實插入片段的序列正確無誤。

M. DNA分子量標準;

1. Stra8 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

圖1Stra8 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2　Western blot分析結果

以未轉染慢病毒重組質粒的293T細胞為對照，轉染了慢病毒重組質粒GV341-Stra8的293T細胞中可檢測到約55 kD大小的片段，其大小與Stra8蛋白相比偏大，但與試劑公司檢測的大小相一致(圖3)，而沒有轉染慢病毒表達載體的293T細胞中沒有檢測到相應大小的條帶。上述結果提示，用慢病毒重組質粒GV341-Stra8轉染293T細胞后能夠表達Stra8蛋白，提示慢病毒重組質粒GV341-Stra8構建成功并具有表達能力。

M. DNA分子量標準; 1. 陰性對照(空載自連對照);

1. 陽性對照SURVIVIN-3FLAG-GFP蛋白;

2. 未轉染慢病毒表達載體的293T細胞;

3. GV341-Stra8慢病毒表達載體轉染293T細胞。

圖3Western blot檢測慢病毒表達載體轉染

293T細胞后Stra8蛋白的表達

3討論

精子發生過程是一個特殊的細胞分化過程，在這一過程中表現出許多體細胞分化過程中所沒有的現象，如減數分裂及精子變態成形。生殖細胞獨特的形態與功能導致其表達的基因必然在一定程度上不同于機體的體細胞，具有在不同時空、組織結構和發育模式中的表達方式[5]，一旦這些基因的表達方式發生變化，必然會引起精子發生和受精過程的病理改變，導致不育癥的產生[6]。

維生素A在哺乳動物多種生理過程中起著必不可少的作用。維生素A一般儲存于肝臟，以視黃醇的形式在血液中運輸，而在靶器官或靶組織中發揮作用的是其活性形式RA。RA在生殖細胞的發生過程發揮著非常重要的作用[7-9]。RA對精子發生過程也發揮著至關重要的作用[9-13]。成年雄性小鼠缺乏維生素A時，生精小管中所有分化后的生精細胞完全消失，僅殘留A型精原細胞和支持細胞。而這種分化后消失的生精細胞在注射RA或給予補充含維生素A飼料后可以重新恢復[14]。因而，RA對于正常的精子發生過程必不可少的[10,14-15]。研究[8,16-17]發現，在胚胎期睪丸中RA氧化酶Cyp26b1的表達使RA失去活性，從而抑制了RA的作用，使精子發生處于未啟動狀態；從青春期開始，Cyp26b1表達減少，RA開始發揮作用，精子發生啟動直至性成熟。

為了研究生殖細胞中受RA調控的基因，1995年法國Bouillet P等[17]研究小組用RA處理小鼠全能的P19胚胎癌細胞，篩選出50個RA反應基因，Stra8是新發現的基因之一[18-20]。進一步研究發現，該基因定位在小鼠第6號染色體上，全長1 455 bp，含有9個外顯子，編碼一個含393個氨基酸的蛋白質。序列同源性比較發現，在人類也有小鼠Stra8的同源基因，二者的同源性為80%[19]。此外，在其他種屬動物如大鼠、牛、狗、恒河猴、大猩猩、灰色短尾負鼠、家雞、紅原雞等中均有Stra8的同源基因，提示Stra8基因是一種進化上高度保守的基因[19]。在胚胎發育的不同時期睪丸組織中Stra8均未見表達，而在成年小鼠的多組織中，Stra8僅在睪丸中表達，而在腦、心、肺、肝、腎、脾臟及卵巢等其他組織中均未見表達[12]。應用免疫組織化學等多種技術，Zhou Q等[20-21]研究發現，Stra8在成年小鼠睪丸生精小管VI-VIII期中Stra8 mRNA水平最高。對Stra8蛋白的亞細胞定位研究表明：Stra8蛋白可同時表達于生殖細胞的胞漿和胞核內，并根據細胞的狀態不同在這兩種部位進行穿梭，從而發揮不同的功能[1-2,19]。

為探討Stra8的作用，Mark M[3]小組構建了Stra8基因敲除小鼠，表型分析發現，除生殖功能外其他器官未見異常表型。雄性小鼠精子發生功能嚴重缺陷，睪丸體積變小，重量減少，不能生育。20%生精小管中僅見精原細胞和支持細胞，在大多數生精小管中可見細線前期及細線期的初級精母細胞，只有少量初級精母細胞呈現出偶線期及粗線期的細胞核，而粗線中期和偶線期的初級精母細胞及減數分裂后的精子細胞等均缺乏。上述表型顯示，在Stra8缺乏的情況下，B型精原細胞可以進行一輪DNA復制，分化為細線前期的精母細胞，進入減數分裂，進一步表型分析發現，進入減數分裂的精母細胞中聯會復合體缺乏或畸形，產生了異型聯會[12]。提示Stra8可能在染色體配對過程中發揮作用。Anderson EL等[22]也構建了不同遺傳背景的Stra8缺陷小鼠，表型分析進一步證實青春期小鼠中Stra8對于細線前期精母細胞的DNA復制過程中并非必須，但對細線前期精母細胞進入減數分裂的染色體濃縮、聯會及DNA同源重組過程是必不可少的。

對Stra8表達調控的研究主要集中在其上游調控分子上，如RA的調控通路[7-13]。研究[23-24]表明，生精細胞在RA作用下可促進Stra8基因的表達，因而RA的合成、來源及降解是調節該基因表達的關鍵。RA激活Stra8基因的表達，可能是通過RA與核受體RXR-RARγ結合形成二聚體，識別并結合在Stra8基因上游的RA反應元件序列而致。CYP26B1可將RA氧化為無活性的形式，降低Stra8的表達，進而阻礙精子發生過程[25-27]。其他研究小組的研究[23-28]發現，SHP和Nanos2蛋白可促進CYP26B1表達，使局部RA濃度降低，進而抑制Stra8基因表達來影響精子發生，同時SHP還可以直接抑制RARs的轉錄活性，導致Stra8的表達減少。DMRT1則在生精細胞中通過限制RA依賴的轉錄，結合到Stra8兩個啟動子附近的RA反應元件上抑制Stra8的轉錄來調控精子發生過程[29]。

目前對Stra8調控的下游分子相關研究鮮有報道。由于Stra8表達于特定階段的生精細胞[10]，且在目前僅有的兩種小鼠永生化的生精細胞株中Stra8蛋白并不表達，這也在一定程度上限制了Stra8功能的體外研究及其下游調控網絡的探索。因此，構建具有穩定表達Stra8蛋白的生精細胞系，并應用該細胞模型進行Stra8功能的研究迫在眉睫。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎發展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。同時慢病毒載體介導的轉基因表達能持續數月，且無可觀察到的病理學現象。據文獻報道及本實驗室前期研究發現，永生化小鼠精原細胞株在進行真核表達質粒轉染時轉染效率較低，穩定表達蛋白的性狀維持時間較短且易丟失。因此，慢病毒表達系統為構建穩定表達Stra8蛋白的精原細胞系提供了可能。

本研究首先通過PCR擴增法，成功獲得了Stra8基因全長開放閱讀框，并將其重組到慢病毒載體GV341上，獲得了慢病毒重組質粒GV341-Stra8，經PCR篩選及序列測定證實插入片段序列準確無誤。將慢病毒重組載體GV341-Stra8轉染到293T 細胞中，用Western blot法檢測發現，轉染后的293T細胞中能夠表達大量的Stra8蛋白。在GV341載體中Stra8插入片段的氨基端含有Flag標簽，因此，作者用Flag的抗體來識別Stra8蛋白。慢病毒載體構建完成后，作者將在此基礎上進行慢病毒的包裝和制備，進而用慢病毒感染生精細胞，從而構建一種穩定過表達Stra8蛋白的生精細胞系，并在此基礎上進行Stra8基因的功能研究。

綜上所述，本研究成功構建了慢病毒表達載體GV341-Stra8，該表達載體能夠通過轉染293T細胞獲得穩定表達的Stra8蛋白。該研究為進一步探索Stra8基因的功能及其作用的分子機制奠定了實驗基礎。

參考文獻

[1]Oulad-abdelghani M, Bouillet P, Decimo D, et al. Characterization of a premeiotic germ cell-specific cytoplasmic protein encoded by Stra8, a novel retinoic acid-responsive gene[J]. Journal of Cell Biology, 1996, 135(2): 469.

[2]Tedesco M, La Sala G, Barbagallo F, et al. STRA8 shuttles between nucleus and cytoplasm and displays transcriptional activity [J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(51):35781.

[3]Mark M, Jacobs H, Oulad-Abdelghani M, et al. STRA8-deficient spermatocytes initiate, but fail to complete, meiosis and undergo premature chromosome condensation [J]. Journal of Cell Science, 2008,121(Pt 19):3233.

[4]Lu C, Xu M, Wang Y, et al. Genetic variants in meiotic program initiation pathway genes are associated with spermatogenic impairment in a Han Chinese population [J]. PLOS One,?2013, 8(1):e53443.

[5]Eddy EM. Regulation of gene expression during spermatogenesis [J]. Seminars in Cell & Developmental Biology, 1998, 9(4): 451.

[6]Stouffs K, Vandermaelen D, Tournaye H, et al. Genetics and male infertility [J].Verh K Acad Geneeskd Belg, 2009, 71(3):115.

[7]Koubova J, Menke DB, Zhou Q, et al. Retinoic acid regulates sex-specific timing of meiotic initiation in mice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(8): 2474.

[8]Bowles, J, Knight, D, Smith, C, et al. Retinoid signaling determines germ cell fate in mice[J]. Science, 2006, 312(5773): 596.

[9]Childs AJ, Cowan G, Kinnell HL, et al. Retinoic Acid signalling and the control of meiotic entry in the human fetal gonad [J]. PLOS One,?2011, 6(6): e20249.

[10]Ghyselinck N B, Vernet N, Dennefeld C, et al. Retinoids and spermatogenesis: lessons from mutant mice lacking the plasma retinol binding protein [J]. Developmental Dynamics, 2006, 235(6): 1608.

[11]Vernet N, Dennefeld C, Rocherre-egly C, et al. Retinoic acid metabolism and signaling pathways in the adult and developing mouse testis[J]. Endocrinology, 2006, 147(1): 96.

[12]Snyder E M, Davis J C, Zhou Q, et al. Exposure to Retinoic Acid in the Neonatal but Not Adult Mouse Results in Synchronous Spermatogenesis [J]. Biology of Reproduction, 2011, 84(5): 886.

[13]Koubova J, Hu Y C, Bhattacharyya T, et al. Retinoic acid activates two pathways required for meiosis in mice [J]. PLOS Genetics, 2014, 10(8): e1004541.

[14]Li H, Palczewski K, Baehr W, et al. Vitamin A deficiency results in meiotic failure and accumulation of undifferentiated spermatogonia in prepubertal mouse testis[J]. Biology of Reproduction, 2011, 84(2): 336.

[15]Busada JT1, Kaye E P, Renegar R H, et al. Retinoic acid induces multiple hallmarks of the prospermatogonia-to-spermatogonia transition in the neonatal mouse[J]. Biology of Reproduction, 2014, 90(3): 64.

[16]Chen W, Jia W, Wang K, et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 418(3): 571.

[17]Wu J W, Wang R Y, Guo Q S, et al. Expression of the retinoic acid-metabolizing enzymes RALDH2 and CYP26b1 during mouse postnatal testis development[J]. Asian Journal of Andrology, 2008, 10(4): 569.

[18]Bouillet P, Oulad-abdelghani M, Vixaire S, et al. Efficient cloning of cDNAs of retinoic acid responsive genes in P19 embryonal carcinoma cells and characterization of a novel mouse gene, Stra1(mouse LERK-2 /Eplg2)[J]. Developmental Biology, 1995, 170(2): 420.

[19]Miyamoto T, Sengoku K, Takuma N, et al. Isolation and expression analysis of the testis-specific gene, STRA8, stimulated by retinoic acid gene 8[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2002, 19(11): 531.

[20]Zhou Q, Nie R, Li Y, et al. Expression of stimulated by retinoic acid gene 8 (Stra8) in spermatogenic cells induced by retinoic acid: an in vivo study in vitamin A-sufficient postnatal murine testes[J]. Biology of Reproduction, 2008, 79(1): 35.

[21]Zhou Q, Li Y, Nie R, et al. Expression of stimulated by retinoic acid gene 8 (Stra8) and maturation of murine gonocytes and spermatogonia induced by retinoic acid in vitro[J]. Biology of Reproduction, 2008, 78(3): 537.

[22]Anderson E L, Baltus A E, Roepers-Gajadien H L, et al. Stra8 and its inducer, retinoic acid, regulate meiotic initiation in both spermatogenesis and oogenesis in mice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(39): 14976.

[23]Gely-Pernot A, Raverdeau M, Célébi C, et al. Spermatogonia differentiation requires retinoic acid receptor γ[J]. Endocrinology, 2012, 153(1): 438.

[24]Kashyap V, Laursen K B, Brenet F, et al. RARγ is essential for retinoic acid induced chromatin remodeling and transcriptional activation in embryonic stem cells[J]. Journal of Cell Science, 2013, 126(Pt 4): 999.

[25]Saba R, Wu Q, Saga Y. CYP26B1 promotes male germ cell differentiation by suppressing STRA8-dependent meiotic and STRA8-independent mitotic pathways[J]. Developmental Biology, 2014, 389(2): 173.

[26]Kumar S, Chatzi C, Brade T, et al. Sex-specific timing of meiotic initiation is regulated by Cyp26b1 independent of retinoic acid signalling [J]. Nature Communications, 2011, 2: 151.

[27]MacLean G, Li H, Metzger D, et al. Apoptotic extinction of germ cells in testes of Cyp26b1 knockout mice[J]. Endocrinology, 2007, 148(10): 4560.

[28]Feng CW1, Bowles J, Koopman P. Control of mammalian germ cell entr into meiosis[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2014, 382(1): 488.

[29]Matson C K, Murphy M W, Griswold M D, et al. The mammalian double sex homolog DMRT1 is a transcriptional gatekeeper that controls the mitosis versus meiosis decision in male germ cells[J]. Developmental Cell, 2010, 19(4): 612.

Construction and identification of mouse Stra8 gene recombinant lentivirus vector

ZHENG Zhe1,2, ZHENG Ying1

(1.DepartmentofHistologyandEmbryology; 2.DepartmentofClinicalMedicine,Medical

CollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the method for construction and identification of Stra8 gene lentiviral expression vector. MethodsStra8 was synthesized with particular primer, amplified by PCR and cloned into the lentiviral vector expression plasmid GV341. After digestion and sequencing, GV341-Stra8 was transfected into 293T cells．Expression of Stra8 protein was detected by Western blot. ResultsThe lentiviral expression vector GV341-Stra8 was constructed. 293T cells transfected with GV341-Stra8 vector were able to express Stra8 protein. ConclusionConstruction of GV341-Stra8 lentiviral expression vector can provide an experiment foundation for further studies of Stra8 function.

KEYWORDS:mouse Stra8; lentivirus vector; 293T cells

通信作者:鄭英, E-mail: yzzkl@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No. 31371174); 江蘇省自然科學基金資助項目(BK20131230);

收稿日期:2014-12-24

中圖分類號:R 596.1

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-011-05DOI: 10.7619/jcmp.201507003