山核桃外果皮的漆酶改性處理研究

王 進， 韓素芳， 張飛英， 劉亞群

(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 杭州 310023)

·研究報告——生物質(zhì)材料·

山核桃外果皮的漆酶改性處理研究

王 進， 韓素芳， 張飛英， 劉亞群

(浙江省林業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 杭州 310023)

為高效利用山核桃外果皮資源，對山核桃外果皮進行了漆酶改性處理。測定了改性處理前后樣品的化學(xué)成分含量，采用SEM觀測改性前后樣品的微觀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)T-IR和13C NMR分析改性處理前后樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：漆酶處理后，山核桃外果皮木質(zhì)素和抽提物含量降低，粉末的分散效果更好，表面更多的木質(zhì)素裸露出來。山核桃外果皮以愈創(chuàng)木基和紫丁香基結(jié)構(gòu)單元為主的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元，在漆酶處理過程中發(fā)生β-O-4斷裂產(chǎn)生較多的活性氧類自由基，使山核桃外果皮表面獲得較多的活性基團，從而具有更高的反應(yīng)活性。

山核桃外果皮；漆酶活化；SEM；FT-IR；13C NMR

我國是山核桃原產(chǎn)國之一，近年來在山核桃品種選育、種植推廣、產(chǎn)品加工、電子商務(wù)等方面均取得了很大的發(fā)展，山核桃產(chǎn)業(yè)逐步成為我國山區(qū)農(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)。山核桃采下山是帶外果皮，俗稱果蒲,在制作加工過程中，首先要將山核桃去蒲再去殼，然后再加工成香脆的山核桃籽。山核桃外果皮與果實質(zhì)量比接近1∶1，據(jù)此推算每年山核桃采摘產(chǎn)生了大量的山核桃外果皮資源，但山核桃外果皮通常是丟棄路邊或者就地焚燒，綜合開發(fā)利用較少?，F(xiàn)在國內(nèi)外已有學(xué)者對山核桃外果皮利用開展了相關(guān)研究，主要集中在提取山核桃外果皮中的化學(xué)成分用來制備抗腫瘤藥物或抑菌劑，或者用于制造活性炭或抗氧化劑等[1-4]。為了更進一步提升資源綜合利用率，促進山核桃產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展，本課題組的前期研究中對山核桃外果皮的化學(xué)成分進行測定并進行改性處理后，以此作為添加劑加入到竹碎料中制造一種環(huán)保型竹刨花板[5]。為更好揭示改性處理的山核桃外果皮作為無甲醛膠黏劑制造環(huán)保型人造板的內(nèi)在機理，本研究探討了漆酶改性處理對山核桃外果皮的微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

山核桃外果皮，在臨安市島石鎮(zhèn)采集，經(jīng)烘干、粉碎后，篩選顆粒粒徑小于178 μm部分待用。漆酶，活性為900 U/mL，購于諾維信中國有限公司(Novozyme China)。磷酸二氫鈉、檸檬酸、硫酸銅、二氯甲烷，均為國產(chǎn)分析純。綜纖維素測定儀，S-3400N掃描電鏡(日本島津公司)，7890A+5975C氣質(zhì)色譜(美國安捷倫公司)，AVANCEⅡ 300MHz核磁共振譜儀(瑞士Bruker 公司)，iS10傅里葉變換紅外光譜儀(美國尼高力公司)。

1.2 漆酶改性處理

山核桃外果皮粉3 g、 60 mmol/L硫酸銅溶液15 mL、漆酶300 μL分別加入50 mL反應(yīng)管中，再將pH值為4的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液加入使反應(yīng)體系總體積為30 mL，漩渦混合均勻，置于水浴溫度60 ℃下處理2 h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，用去離子水洗滌殘留固體，在50 ℃下干燥24 h。

1.3 分析與表征

1.3.1 化學(xué)成分分析 根據(jù)造紙原料國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 2677.4—1993、 GB/T 2677.6—1994、 GB/T 2677.5—1993、 GB/T 2677.8—1994、 GB/T 2677.9—1994、 GB/T 2677.10—1995和GB/T 2677.3—1993，分別測定改性前后樣品的冷水/熱水抽提物、苯醇抽提物、1% NaOH抽提物、酸不溶木質(zhì)素、多戊糖、綜纖維素和灰分等成分含量。

1.3.2 SEM分析 采用掃描電子顯微鏡在加速電壓12.5 kV下觀察改性前后樣品的微觀形貌。

1.3.3 FT-IR分析 采用溴化鉀壓片法對改性前后的樣品做紅外光譜(FT-IR)分析。

1.3.413C NMR分析 溶劑為氘代DMSO, 以13C NMR表征改性前后山核桃外果皮粉末的結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)成分分析

山核桃外果皮漆酶改性處理前后的化學(xué)成分測定結(jié)果以及文獻報道的松木、楊木、毛竹的化學(xué)成分含量結(jié)果[6-8]，見表1。改性前，山核桃外果皮的木質(zhì)素含量達到46.13%，要遠高于松木的26.08%、楊木的19.85%和5年生毛竹竹材的25.06%。同時，山核桃外果皮的綜纖維素和多戊糖含量遠低于木材和竹材。在不同溶劑抽提物中，冷水抽提物和熱水抽提物含量較木材和竹材高，1% NaOH抽提物含量最高，可見天然山核桃外果皮中具有較高含量易被堿溶出的物質(zhì)。經(jīng)漆酶改性處理后，木質(zhì)素含量降低，多戊糖的含量升高，綜纖維素含量升高，抽提物含量下降，尤其是冷水、熱水和1% NaOH抽提物含量下降明顯。漆酶的改性處理最主要的是降低了木質(zhì)素含量及抽提物的含量，由此表明，漆酶主要作用于山核桃外果皮中的木質(zhì)素容易被水、氫氧化鈉抽提出的成分。

表1 改性前后山核桃外果皮的化學(xué)成分變化1)

1)以絕干物料為基準(zhǔn)based on dry bagasse

2.2 微觀形貌分析

圖1為樣品的SEM圖，可觀察到改性處理前的山核桃外果皮粉末表面未被破壞且形成團聚，而處理后的山核桃外果皮粉末分散較開，表面遭到破壞，即漆酶處理后粉末具有更好的分散效果，由此可知漆酶處理后容易使山核桃外果皮改性粉末表面有更多的木質(zhì)素裸露出來，這與文獻[9]的結(jié)論相吻合，在粉末表面容易形成更多具有高反應(yīng)活性的活性氧自由基。若將漆酶改性處理后的山核桃外果皮粉末加入到竹刨花材料中，在熱壓條件下更容易參與反應(yīng)生成膠黏物質(zhì)，證實了山核桃外果皮粉末進行改性處理后可作為膠黏物質(zhì)予以開發(fā)利用。

圖1 山核桃外果皮粉末SEM圖

2.3 FT-IR分析

2.4 核磁共振波譜分析

圖3為改性處理前后的山核桃外果皮粉末的13C NMR譜圖。

圖2 改性處理前后山核桃外果皮粉末的FT-IR圖 圖3 改性處理前后的山核桃外果皮粉末的13C

由圖3可知，未改性山核桃外果皮粉末在δ20.92處是飽和側(cè)鏈中的CH3；δ30.53處是軛酮的側(cè)鏈CH3；δ55.93和δ64.85處是C-γ、β-O-4 單元和C-β、β-O-4 單元；δ72.63和δ88.00處是C-α、β-O-4 單元和C-β、β-β單元[12-13]；δ105.26處C-2/C-6、紫丁香基單元；δ116.53處是C-3/C-5；δ153.32處是C-3/C-5、紫丁香基單元；δ173.74處為對香豆酯或阿魏酸醚的γ位。改性后山核桃外果皮粉末在δ26.82處是軛酮的側(cè)鏈CH3；δ49.98處是C-γ、β-O-4單元；δ58.38處是C-β、β-O-4 單元；δ67.03處是C-α、β-O-4 單元；δ76.05處是C-β、β-β單元；δ98.73處是C-2 /C-6、紫丁香基單元[14]。

對比分析可知，未改性山核桃外果皮粉末的吸收峰明顯比改性處理后樣品要多。對于改性前樣品，飽和側(cè)鏈和軛酮中的CH3較多，主要結(jié)構(gòu)以C-α、C-γ、β-O-4 單元等為主，其中β-O-4 單元所占的比例最大，β-β結(jié)構(gòu)的含量較少?？芍胶颂彝夤ぶ心举|(zhì)素單元的鏈接方式主要是β-O-4 結(jié)構(gòu)。改性后山核桃外果皮粉末改性后較改性前其吸收位置有一定程度的藍移，山核桃外果皮粉中飽和側(cè)鏈中的CH3、紫丁香基單元和C-3/C-5等相對改性前減少，表明改性處理導(dǎo)致了山核桃外果皮中木質(zhì)素在漆酶處理中發(fā)生催化降解，主要發(fā)生木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元β-O-4結(jié)合處斷裂，結(jié)合文獻[9]可知斷裂過程產(chǎn)生的活性氧類自由基較多，有利于粉末表面的活性官能團數(shù)量提高，起到活化山核桃外果皮的效果，提高其參與化學(xué)反應(yīng)的活性。

3 結(jié) 論

3.1 對山核桃外果皮進行漆酶改性處理，測定了改性處理前后樣品的化學(xué)成分含量，并采用SEM觀測改性前后樣品的微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，改性后木質(zhì)素含量及抽提物的含量降低，山核桃外果皮分散效果更好，使其表面更多的木質(zhì)素裸露出來。由此說明，漆酶主要作用于山核桃外果皮中木質(zhì)素和容易被水、氫氧化鈉溶液抽提出的成分。

3.2 采用FT-IR和13C NMR對山核桃外果皮改性前后樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明，山核桃外果皮木質(zhì)素以愈創(chuàng)木基和紫丁香基結(jié)構(gòu)單元為主，在漆酶催化降解反應(yīng)中主要發(fā)生β-O-4斷裂，從而產(chǎn)生了較多的活性氧類自由基進入反應(yīng)溶液中，同時山核桃外果皮表面獲得較多的活性基團，提高了其參與化學(xué)反應(yīng)的活性。

[1]孫小紅,劉秀飛,王國夫,等.山核桃外果皮提取物抗腫瘤活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(7):1612-1613.

[2]林君陽,馬良進,陳安良,等.山核桃外果皮化學(xué)成分及抑菌活性初步研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,2009,26(1):100-104.

[3]章江麗,莊曉偉,陳順偉,等.山核桃等3種果蓬化學(xué)成分分析和利用評價的研究[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2010,44(6):36-39.

[4]周曄,王偉,陶冉,等.超聲波提取核桃內(nèi)種皮多酚的響應(yīng)面優(yōu)化及其抗氧化研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2013,33(4):73-78.

[5]王進,張飛英,韓素芳,等.改性山核桃外果皮/竹刨花板制造工藝研究[J].2015,22(8):4-8.

[6]李萍萍,雷以超,陳燦,等.熱水預(yù)水解對松木及其水解液主要化學(xué)成分的影響[J].中國造紙,2012,31(11):1-6.

[7]閆興偉,崔琳,張林,等.楊木制備纖維乙醇過程中化學(xué)成分變化的分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2015,35(2):119-122.

[8]張齊生,關(guān)明杰,紀(jì)文蘭.毛竹材質(zhì)生成過程中化學(xué)成分的變化[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2002,26(2):7-10.

[9]金春德,王進,毛勝鳳,等.漆酶活化產(chǎn)生的活性氧類自由基與竹粉板性能的關(guān)系[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,31(2):119-121.

[10]朱明華.儀器分析[M].北京:高等教育出版社,2000.

[11]李堅.木材波譜學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2003.

[12]陳曉旭,孫付保,張建華,等.麥草木質(zhì)素在甘油蒸煮過程中結(jié)構(gòu)的變化[J].化工進展,2010,29(12):2330-2335.

[13]海蘭,程明娟,洪樞,等. 漆酶-超聲波協(xié)同處理堿木質(zhì)素的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)特征[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2014,34(4):90-96.

[14]康素敏,周金池.核磁共振波譜在木素結(jié)構(gòu)研究中的最新應(yīng)用[J].中國造紙,2012,31(10):58-63.

Laccase Treatment of Cathay Hickory Ectocarp

WANG Jin, HAN Su-fang, ZHANG Fei-ying, LIU Ya-qun

(Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China)

In order to use the resources of the cathay hickory exocarp efficiently, the ectocarp powder was treated by laccase. The chemical compositions of the samples were determined, the microstructures of the lacasse treated and untreated ectocarp were observed by SEM, and the chemical structures of the samples were analyzed by using FT-IR and13C NMR. The results showed that after laccase activation, the contents of lignin and extracts of cathay hickory ectocarps de creased and the powders were dispersed better, moreover, there was more exposed lignin on the surface. And the guaiacyl and syringyl lignin were degraded byβ-O-4 fracture, and meanwhile more reactive oxygen species free radicals produced. This made the ectocarp surface to obtain more active groups and had higher reaction activity.

cathay hickory ectocarp; laccase activation; FT-IR;13C NMR; SEM

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.06.006

2015- 06- 24

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(2013C32104)

王 進(1984—)，男，湖北通山人，助理研究員，博士生，研究方向：木材科學(xué)與技術(shù)；E-mail:whuwj@sina.com。

TQ35

A

1673-5854(2015)06- 0027- 04