木醋液體外抗氧化活性評價

段曉玲， 王海英， 劉志明， 馮 晨， 余森海

(1.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業大學 材料科學與工程學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

·研究報告——生物質活性成分·

木醋液體外抗氧化活性評價

段曉玲1， 王海英1*， 劉志明2， 馮 晨1， 余森海2

(1.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業大學 材料科學與工程學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

對比了白樺、雜木、木屑以及蒸餾木屑4種木醋液的還原能力，二苯基苦基肼自由基(DPPH·)的清除能力和羥基自由基(·OH)的清除能力。結果表明，4種木醋液有較強的還原能力，其中還原能力最強的是木屑木醋液，半數有效濃度(EC50)為(1.73±0.06)g/L；4種木醋液可有效清除DPPH·，木屑木醋液清除效果最佳，半數抑制濃度(IC50)為(0.20±0.01)g/L；4種木醋液的·OH清除能力相對較弱，除木屑木醋液IC50為(9.69±0.20)g/L外，其他3種木醋液清除率均未達到50%。

木醋液；抗氧化；還原能力；自由基清除能力

生物質原料通過熱解可以轉化為高附加值的炭、生物油和可燃氣[1]，其中生物油中木醋液含酸、醇、酚、酯、羰基類及呋喃類等約500種有機成分[2]，有機成分中酚類是作用較強的天然抗氧化物質[3]。木醋液最初是在日本發現并發展起來的，木醋液精制后可用作抗氧化劑[4]、殺蟲劑[5]和抑菌劑[6]等，印度用木醋液來抑制艾滋病毒復制和病毒引起的細胞病變效應，馬來西亞則將木醋液用作滅菌劑、除臭劑、肥料等等，植物醋液的研究主要集中在成分分析、抑菌活性等領域[7]，關于木醋液抗氧化活性的研究目前還較少報道[8-9]。常用的化學合成抗氧化劑如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、2-叔丁基對苯二酚(TBHQ)等，雖抗氧化性能較佳但卻有一定的毒副作用，隨著人們的營養和安全意識的逐漸提高，天然無副作用抗氧化劑的開發越來越引起研究人員的重視[10-11]。在本課題組前期對木醋液的成分及其對植物生長調節研究的基礎上[12-13]，本研究對白樺、雜木、木屑以及蒸餾木屑4種木醋液的還原能力、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)的清除能力和羥基自由基(·OH)的清除能力進行了對比，以此評價木醋液的抗氧化活性，以期為天然抗氧化劑的開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白樺木醋液(BWV)按文獻[13]制備后備用。雜木(蒙古櫟、白樺、水曲柳、榆樹)木醋液(MWV)，炭窯法燒制收集，通過硅藻土吸附，加速木醋液原液快速沉降，過濾，再經臭氧發生器處理30 min脫色后得到。木屑(松木屑)木醋液(SWV)，干餾釜干餾法制備收集，經制取后靜置處理得到。蒸餾木屑(松木屑)木醋液(DWV)，由SWV蒸餾處理得到。

沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、抗壞血酸(Vc)、水楊酸，均為分析純。

722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.2 木醋液酚、酸類物質含量測定

參照國標GB/T 8313—2008，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑比色法測定總酚含量。以沒食子酸為標樣，將沒食子酸配制成1 000 mg/L的標準液，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒食子酸標準液并定容至100 mL，配制成質量濃度為10、20、30、40、50 mg/L的標準溶液。精確吸取沒食子酸標準溶液、水、待測樣液各1.0 mL分別于刻度試管中，加入5.0 mL質量分數為10%的Folin-Ciocalteu試劑，搖勻。反應3～8 min，加入質量分數為7.5%的Na2CO3溶液4.0 mL，定容至10.0 mL，室溫下放置60 min，在765 nm波長處測其吸光度。繪制吸光度與沒食子酸質量濃度的標準曲線，擬合線性回歸方程并計算木醋液總酚含量。木醋液總酸含量參照文獻[14]采用酸堿滴定法測定。

1.3 抗氧化試驗

1.3.1 還原能力測定 在眾多抗氧化機制中，還原能力是一個重要的指標，其強弱反映內源性抗氧化活性的變化，其測定原理是：還原性物質將K3Fe(CN)6還原，再和Fe3+形成普魯士藍[Fe4(Fe(CN)6)]，根據普魯士藍生成量作為還原能力大小的指標[15]。普魯士藍在700 nm處有吸收峰，且存在定量關系，顏色越深，吸光度越大，還原能力越強。參考文獻[16]的方法，取1 mL不同濃度的樣液于試管中，依次加入2.5 mL的 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值 6.6)和2.5 mL的質量分數1% K3Fe(CN)6溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min后，快速冷卻，再加入2.5 mL的質量分數10%三氯乙酸，離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL的質量分數0.1%三氯化鐵，充分混勻，在700 nm下測其吸光度(以蒸餾水作空白調零)。每個濃度平行操作3次，取平均值。

1.3.2 DPPH·清除率測定 二苯基苦基肼自由基(DPPH·) 是一種穩定的自由基，含有3個苯環和1個含孤對電子的氮原子[17]。DPPH·乙醇溶液為紫色，當自由基清除劑與其單個電子配對時，溶液顏色會隨著自由基濃度降低而變淺，褪色程度與配對電子的數量呈化學計量關系，所以可以用吸光值的降低來判斷供試樣品對 DPPH·的清除率[18]。參考文獻[19]的方法，分別移取1.0 mL不同濃度的樣液于試管中，加入3.0 mL的0.1 mmol/L DPPH·溶液，立即混勻，室溫放置15 min，測定517 nm的吸光度(Ai)，同時測定1.0 mL樣液加入3.0 mL無水乙醇的吸光度(Aj)及1.0 mL無水乙醇加入3.0 mL的DPPH·溶液的吸光度(A0)。實驗以1.0 mL蒸餾水和3.0 mL無水乙醇混合液作參比。每個濃度平行操作3次，取平均值。根據以下公式計算試樣對DPPH·清除率(RDPPH·)：

1.3.3 ·OH清除率測定 Fenton反應中，檢測木醋液對羥基自由基(·OH)的清除作用，過氧化氫和鐵離子混合產生羥基自由基，在體系內加入水楊酸產生有色物質，該物質在510 nm波長處有最大吸收波長[20]。參考文獻[21]的方法，向試管中依次加入1 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL、不同濃度的樣液1.0 mL、1 mmol/L的H2O21.0 mL、3 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL，混勻，室溫下放置30 min，于510 nm處測定吸光度(Ai′)，用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度(Aj′)，用蒸餾水代替樣液測定吸光度(A0′)。每個濃度平行操作3次，取平均值。根據以下公式計算試樣對·OH清除率(R·OH)：

1.4 數據分析與處理

采用Excel 2007、SPSS19.0軟件進行數據統計分析、處理，數據都以均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 醋液酚、酸類物質含量測定

酚類物質是結構復雜、種類繁多并且生理功能具有多樣性的植物次生代謝產物，通過GC-MS分析

表1 木醋液酚、酸類物質含量比較

1)同列不同小寫字母表示差異顯著，下表同different lowercase letters in the same column indicated significant difference，similar in the following table

木醋液成分，證明其中酚類和有機酸類化合物含量達到總有機物的70%，且木醋液中酚、酸類物質具有顯著體外抗氧化活性[22-23]。按照1.2節的方法制作標準曲線，得到木醋液中總酚質量濃度的回歸方程為y=0.011 8x-0.008 4(R2=0.999 5)，由回歸方程可計算出總酚質量濃度(見表1)。4種木醋液中酸類物質含量亦列入表1。

由表1可知，木醋液中總酚、總酸物質含量會隨著制備材料種類以及制取后的處理方法而變化。4種木醋液酚、酸類物質含量均差異顯著，具有統計學意義。雜木木醋液、木屑木醋液、蒸餾木屑木醋液3種木醋液中酚、酸類物質含量較高，其中木屑木醋液總酚含量最高。由表1還可看出，木屑木醋液和蒸餾木屑木醋液總酚含量相差較多，可能是由于在蒸餾的過程中，在除掉焦油的同時也損耗了酚類等有機成分。

圖1 木醋液的還原力

2.2 抗氧化試驗結果

2.2.1 還原能力 4種木醋液還原能力測定結果見圖1。由圖1可以看出，4種木醋液都有一定的還原能力，但不同的木醋液還原能力不同，雜木木醋液、木屑木醋液及蒸餾木屑木醋液3種木醋液的還原能力更強，白樺木醋液還原能力相對較弱。木醋液的還原能力與濃度之間呈現出顯著的相關性，擬合線性方程如表2所示，相關系數R2分別為0.957 4、 0.982 4、 0.965 9、 0.933 3。BWV在質量濃度為180 g/L時，吸光度僅能達到0.350，濃度升高時吸光度隨之下降；MWV質量濃度在3～30 g/L的范圍內，吸光度可達到0.886；SWV質量濃度在0.4～4 g/L的范圍內，吸光度可達到0.952；DWV質量濃度在20～200 g/L 范圍內時，還原能力隨著濃度升高逐漸增強，質量濃度為200 g/L時，吸光度可達到0.968。從半數有效濃度(EC50)角度看，BWV吸光度達不到0.5，而MWV、SWV及DWV的EC50分別為(15.25±0.22)、(1.73±0.06)和(59.62±4.01)g/L(表3)，前期研究得到抗壞血酸的EC50值為0.057 g/L[24]，由此看出相對于抗壞血酸來說，木醋液的還原能力還是相對較弱。

表2 木醋液的還原能力線性方程

2.2.2 DPPH·清除率 4種木醋液的 DPPH·清除率見圖2。由圖2可知，4種木醋液對 DPPH·均有較好的清除能力，且在木醋液濃度較低時，清除率隨著木醋液濃度的升高而迅速增強，有較好的量效關系；當濃度升高至一定程度后，清除率曲線逐漸趨于平緩。質量濃度在7～70 g/L的范圍內，BWV對DPPH·的清除率最高達94.34%；質量濃度在0.5～5 g/L范圍內，MWV的清除率最高達93.92%；質量濃度在0.1～1 g/L的范圍內，SWV的清除率最高達到93.52%；質量濃度在10～100 g/L的范圍內，DWV的清除率最高達到89.74%。由此可以看出4種木醋液對 DPPH·有很強的清除能力。從IC50角度來評價，BWV、 MWV、 SWV和DWV 4種木醋液清除DPPH·的 IC50分別為(25.48±1.09)、(1.22±0.06)、(0.20±0.01)和(13.63±1.23)g/L(表3)，SWV的IC50值明顯低于其他樣品。前期研究得出抗壞血酸半數抑制濃度(IC50)為0.02 g/L[24]，SWV的IC50值稍高于抗壞血酸，即SWV的DPPH· 清除能力低于抗壞血酸。

2.2.3 ·OH清除率 4種木醋液的·OH清除率見圖3。

圖2 木醋液的 DPPH·清除率 圖3 木醋液的羥自由基清除率

由圖3可知，4種木醋液對·OH均有一定的清除作用，且清除作用對木醋液濃度有依賴關系。質量濃度在2～20 g/L范圍內，SWV對·OH的清除率最高達到59.87%，隨著濃度升高清除作用不再增強。從IC50角度來看，BWV、MWV和DWV這3種木醋液對·OH清除率最高達不到50%，而SWV的·OH IC50為(9.69±0.20)g/L(表3)，抗壞血酸為0.1 g/L[24]，說明相對抗壞血酸來說，4種樣品對·OH的清除能力相對較弱。

2.3 抗氧化活性的IC50(EC50)比較

表3為木醋液抗氧化活性的IC50(EC50)比較。

表3 木醋液抗氧化活性的IC50(EC50)比較

為了更準確地評價樣品的抗氧化活性，常用自由基清除率50%時的溶液質量濃度(IC50)或吸光值為0.5時的溶液質量濃度(EC50)來比較，較低的IC50(EC50)值表示較高的自由基清除能力[25]。從表3可知，4種木醋液還原能力(EC50)差異顯著(p<0.05)，SWV的EC50最低，還原力最強；清除DPPH·的IC50差異顯著，SWV最低，BWV最高，SWV清除DPPH·能力最強；除SWV外，其他3種木醋液·OH清除率最高時也未達到50%。

3 結 論

3.1 實驗通過對白樺木醋液(BWV)、雜木木醋液(MWV)、木屑木醋液(SWV)和蒸餾木屑木醋液(DWV)的還原能力、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)清除力、羥基自由基(·OH)清除力的測定，得出4種木醋液均具有一定的抗氧化活性。

3.2 MWV、SWV、DWV 3種木醋液具有較強的還原能力，其中SWV的半數有效濃度(EC50)最低為1.73±0.06 g/L，BWV還原能力較弱，吸光度未達到0.5；4種木醋液均表現出較強的DPPH·清除能力，SWV清除DPPH·的IC50最低為(0.20±0.01)g/L；清除·OH的IC50為SWV(9.69±0.20)g/L，另外3種木醋液清除率未達到50%。

3.3 采用SPSS19.0軟件，對木醋液酚、酸類物質含量與體外抗氧化活性各指標IC50(EC50)進行相關性分析，結果得出酚、酸類物質含量與IC50(EC50)均為負相關，酚、酸類物質含量越高，IC50(EC50)越低，說明木醋液中酚、酸類物質是重要的抗氧化物質。

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Evaluation of Antioxidant Activities of Wood Vinegarinvitro

DUAN Xiao-ling1,WANG Hai-ying1,LIU Zhi-ming2,FENG Chen1,YU Sen-hai2

(1.College of Forestry,Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2.College of Material Scienceand Engineering,Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The reducing power and the scavenging activities against phenyl picryl hydrazine radical (DPPH·) and hydroxyl radical (·OH) of birch wood vinegar(BWV), miscellaneous wood vinegar(MWV), sawdust wood vinegar(SWV), and distillated sawdust wood vinegar(DWV) were determined. The results showed that four kinds of wood vinegar had strong reducing power and the reducing power of sawdust wood vinegar was the strongest with the half effective concentration (EC50) of (1.73±0.06) g/L. Wood vinegar could effectively scavenge DPPH·, and DPPH· scavenging activity of sawdust wood vinegar was the highest with the median inhibitory concentration (IC50) of (0.20±0.01) g/L. Wood vinegar showed relatively weak ·OH scavenging ability, except the IC50of sawdust wood vinegar was (9.69±0.20) g/L, the ·OH scavenging rates of the other three kinds of wood vinegar couldn′t reach 50%.

wood vinegar;antioxidant;reducing power;radical scavenging

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.06.005

2015- 06- 04

黑龍江省自然科學基金項目(C201411)；哈爾濱市科技創新人才項目(2014RFXXJ038)

段曉玲(1990—)，女，云南騰沖人，碩士生，主要從事植物資源開發利用研究

*通訊作者：王海英，副教授，碩士生導師，博士，主要從事植物資源化學以及木醋液、精油、纖維素等林下經濟資源利用研究；E-mail:haiyingwang908@126.com。

TQ352

A

1673-5854(2015)06- 0022- 05