富血小板纖維蛋白蓋髓的動物實驗研究

富血小板纖維蛋白蓋髓的動物實驗研究

李響1，孫淑芬1*，姜南1，武興2

(1.吉林大學口腔醫學院，吉林 長春130021;2.吉林大學第一醫院)

直接蓋髓術是用藥物覆蓋在牙髓暴露處,以保護牙髓、保存牙髓活力的方法。而直接蓋髓術能否成功與蓋髓劑有著密切的關系,尋找一種性能優越的蓋髓材料一直是學者們所關注的問題。富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是一種富含自體細胞因子和生長因子的新型生物材料。目前PRF已經被應用于口腔頜面外科、牙周科和口腔種植等領域，并均取得了較好的臨床療效，但關于將PRF作為蓋髓劑應用于牙體的報道卻很少。據報道，PRF具有很好的促進牙髓細胞增殖和分化的能力，且在組織愈合、炎癥調節和抗感染方面也具有良好的效果[1，2]。本實驗以PRFDycal、Dycal及PRF分別作為蓋髓劑對家兔門齒進行直接蓋髓術，觀察術后牙髓的炎癥情況和修復性牙本質的形成程度。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組選取3.0-3.5 kg的健康家兔21只及對照兔1只(購于吉林大學口腔醫院動物實驗室)，左右上頜前牙共42顆實驗牙，分為3組：PRFDycal組、Dycal組和PRF組，5 d和10 d兩個實驗周期。

1.2主要材料和試劑Dycal(登士柏，美國)、玻璃離子水門汀(上海醫療器械股份有限公司齒科材料廠)、臺式低溫高速離心機(貝克曼儀器公司 美國)、電子天平(上海越平科學儀器有限公司)、顯微鏡及照相系統(日本)、自動脫水處理機(徠卡顯微系統上海有限公司)、常規手術器械(吉林大學口腔醫院病理科提供)

1.3實驗方法

1.3.1實驗步驟自家兔耳中動脈采血制備PRF膜[1]。按0.1 ml/kg注射氯眠寧麻醉動物，仰臥固定；用3%的H2O2液清潔口腔，洗必泰消毒實驗牙齒；用006球鉆在唇側頸部制洞，見洞底透紅后，用自制直徑0.5 mm的探針輕輕穿髓，生理鹽水沖洗，無菌棉球輕壓止血，將蓋髓劑分別放于漏髓處，然后以玻璃離子水門汀充填窩洞。

1.3.2組織學標本制作分別在術后5 d和10 d灌流處死實驗動物，分離上下頜骨，4%多聚甲醛固定72 h，15%EDTA(pH=7.2-7.4)脫鈣6周，自動脫水機脫水，包埋，以平行于牙長軸方向做頰舌向連續切片，HE染色，樹膠封片，光鏡下進行組織學觀察。

1.4統計學方法

采用 SPSS 17.0 軟件包進行統計學分析?？ǚ綑z驗分析數據。P<0．05 表示差異有統計學意義。

2結果

PRFDycal、Dycal及PRF分別作為蓋髓劑對家兔門齒進行直接蓋髓術，術后5d組織學觀察結果見圖1。PRFDycal組(圖1a)：均未見修復性牙本質橋形成。4例露髓口下方可見散在的鈣化團塊，大量炎癥細胞聚集。2例無鈣化物形成，露髓口下方大量中性粒細胞、漿細胞聚集，血管數量增加，擴張充血明顯。1例牙髓細胞壞死或崩解，髓腔空虛。Dycal組(圖1b)：均未見修復性牙本質橋形成。4例露髓口下方可見散在的鈣化團塊，大量炎癥細胞聚集。3例牙髓細胞壞死或崩解，髓腔空虛。PRF組(圖1c)：均未見修復性牙本質橋形成。4例無鈣化物形成，露髓口下方大量中性粒細胞、漿細胞聚集，血管數量增加，擴張充血明顯。3例牙髓細胞壞死或崩解，髓腔空虛。術后10d組織學觀察結果見圖1。PRFDycal組(圖1d)：3例可見修復性牙本質橋形成，髓腔內可見散在的鈣化團塊，露髓口下方可見少量炎細胞或無炎細胞。4例無完整修復性牙本質橋形成，但髓腔內可見大量鈣化團塊形成，隔絕損傷處與健康牙髓，露髓口下方可見中等程度炎細胞聚集及血管增生、擴張充血。Dycal組(圖1e)：1例可見修復性牙本質橋形成，髓腔內可見散在的鈣化團塊，中等程度炎細胞聚集。2例無完整修復性牙本質橋形成，但髓腔內可見大量鈣化團塊，呈彌漫性鈣化。4例牙髓細胞壞死或崩解，髓腔空虛。PRF組(圖1f)：1例髓腔內可見少量鈣化團塊形成，2例未見鈣化團塊形成，此3例牙髓內均有大量炎癥細胞聚集，血管數量增加，擴張充血明顯。4例牙髓細胞壞死或崩解，髓腔空虛。

a PRFDycal直接蓋髓后5 d(HE×40)；b Dycal直接蓋髓后5 d(HE×40)；c PRF直接蓋髓后5 d(HE×40)；d PRFDycal直接蓋髓后10 d(HE×40)；e Dycal直接蓋髓后10 d(HE×40)；f PRF直接蓋髓后10 d(HE×40)；g 正常牙髓組織(HE×40)

圖1HE染色圖片

3討論

目前臨床常用的蓋髓材料中，以氫氧化鈣制劑的應用最為廣泛，且療效也相對肯定，是常規蓋髓材料的金標準[3]，故選作本實驗的對照材料。有機生物材料對修復性牙本質形成具有很強的促進作用，但異體生物材料存在潛在的排異反應，獲取成本也較高，不適合臨床推廣應用[4]。富血小板纖維蛋白(PRF)是新一代自體有機生物材料，取材簡便，成本低廉，且不存在免疫排斥反應。PRF中含有大量的血小板和白細胞，其纖維蛋白將血小板與生物因子以化學鍵的方式相結合，并可緩慢釋放其中的生物因子，包括血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB) 、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血管內皮生長因子(VEGF )、胰島素樣生長因子(IGF-1)、表皮生長因子 (EGF) 等[5]。

本實驗選取家兔作為實驗動物，由于家兔屬大型嚙齒類動物，身體抵抗力好，便于取血，牙齒生長速度快，牙髓自身修復能力較強，雖然與人類牙齒存在較大差異，但其快速修復能力可使我們能夠在PRF有效釋放主要生物因子期間觀察到PRF在牙髓損傷修復中的作用。有研究指出，PRF能夠緩慢釋放生物因子持續7-10天[6]，最長可達28 d[7]。故本實驗設計5 d和10 d兩個周期，本實驗周期的設計與家兔牙齒的生長速度和PRF的生物因子釋放速度相吻合。

體外研究指出，PRF促進牙髓細胞增殖和分化，顯著上調堿性磷酸酶(ALP)和骨保護素(OPG)的表達，促進修復性牙本質的形成[2]。另有大量研究證明，PRF主要通過緩慢釋放生物因子實現其生物學作用，PRF釋放的生物因子在牙髓損傷修復中具有重要的作用，其中，PDGF-AB對多種細胞均具有強效的趨化作用，促進牙髓細胞增殖和分化，同時它又是成纖維細胞的有絲分裂劑，促使成纖維細胞增殖[8,9]。TGF-β1和EGF均可促進牙髓細胞增殖、遷移和分化，且TGF-β1 在損傷的牙髓中還參與基質的分泌和免疫反應過程[10,11]。

以上研究均是PRF在體外的諸多促進表現，根據其表現我們推測，PRF可能會在牙髓損傷修復中發揮其積極的生物學作用，故我們進行了此項實驗研究，但PRF組卻得到了與預期相反的結果。PRF組結果顯示：術后5 d時和10 d時，幾乎無修復性牙本質形成，且牙髓內呈現不同程度的炎癥表現。為什么性能優越的PRF在本實驗中卻沒有優越的結果出現，我們分析原因可能是：試驗中我們在PRF外以玻璃離子水門汀封洞，而玻璃離子對牙髓具有一定的刺激性，會引起牙髓壞死；另外，PRF膜直接覆蓋在露髓口上，其封閉性能較差，加之PRF膜表面濕度較大，而玻璃離子遇水不易固化，影響其封閉性，易形成邊緣微滲漏[12]。術后難以避免細菌侵入牙髓，使牙髓受到了外界的污染刺激，而刺激程度超過了PRF的修復能力，導致PRF的優越性能不能體現出來，至牙髓崩解壞死，這可能是引起本實驗PRF組出現陰性結果的主要原因。

雖然PRF組的結果不盡如人意，但本實驗還出現了另外一種非常值得我們思考的結果：術后5 d，PRFDycal組與Dycal組均無牙本質橋形成，但牙髓內均有修復性牙本質鈣化團塊形成，無統計學差異；而術后10 d，PRFDycal組除了有多例牙本質橋形成外，牙髓內還有大量的修復性牙本質的鈣化團塊形成，且形成量及例數均明顯較Dycal組多，具有統計學差異。我們還觀察到，在PRFDycal組所形成的大量修復性牙本質鈣化團塊中多處可見被包裹的成牙本質細胞(如圖d)。這可能由于PRFDycal激活牙髓內的未分化的間充質細胞分化為成牙本質細胞或為損傷的成牙本質細胞，在損傷部位快速分泌牙本質基質，由于形成速度過快，導致部分成牙本質細胞被包裹在鈣化團塊中，形成一種骨樣牙本質狀的鈣化物。PRFDycal組之所以出現如此顯著的療效，我們分析原因可能由于兩種材料互相促進，取長補短，各自發揮優勢導致的。因為Dycal的顆粒小，流動性好，可以覆蓋PRF及其邊緣，并很快凝固，故邊緣封閉性良好，且硬度及強度較大[3]，彌補了PRF封閉性差、濕度大的缺點，并保持了PRF緩慢釋放生物因子和促進細胞增殖、分化及修復性牙本質形成的優點；同時PRF也緩沖了Dycal的強堿性，減輕了Dycal的細胞毒性，彌補了Dycal生物相容性差的缺點[14]，并保持了其抗菌性及促進修復性牙本質形成的優點[3,13]。兩個周期內，PRFDycal組均無變性和壞死現象出現，而Dycal組出現多例牙髓彌漫性鈣化、變性和壞死，可能由于Dycal具有強堿性，易造成與之相接觸的牙髓組織出現局部變性和壞死導致的[14]。

更值得關注的是，PRFDycal組有鈣化橋形成的樣本中炎癥明顯減輕甚至無炎癥，而Dycal組和PRF組均存在不同程度的炎癥。可能由于PRF中富含大量與免疫調節相關的細胞因子， Dohan DM 等分析PRF中存在的主要白細胞，包括3種促炎細胞因子IL-1β，IL-6,TNF-α，一個抑炎細胞因子IL-4和一個血管生成促進因子VEGF，它們通過分泌細胞因子作用于止血和炎癥反應過程，研究結果顯示PRF具有促進組織愈合，在炎癥調節和抵抗感染方面可能發揮一定的積極作用[1]。說明PRF在有Dycal存在時的抗炎調節作用更加顯著。

本實驗以PRF作為蓋髓劑應用于牙髓損傷的修復治療中，對其可行性和應用方式進行初步探索，從本次試驗的結果中可以得出結論：PRFDycal可以更好的發揮促進修復性牙本質形成和抗炎調節的作用。但單獨以PRF膜作為蓋髓材料在封閉性能上存在著一定的缺陷，有望在后續實驗中將此材料的應用方式改良，使其更有效的發揮優勢。

參考文獻：

[1]Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF):a second-generation platelet concentrate[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101:e37.

[2]Huang FM,Yang SF,Zhao JH,et al.Platelet-rich fibrin increases proliferation and differentiation of human dental pulp cells[J].J Endod,2010,36(10):1628.

[3]Parolia A,Kundabala M,Rao NN,et al.A comparative histological analysis of human pulp following direct pulp capping with Propolis,mineral trioxide aggregate and Dycal[J].Aust Dent J,2010,55(1):59.

[4]Ko H，Yang W，Park K，et al.Cytotoxicity of mineral trioxide aggregate ( MTA) and bone morphogenetic protein 2(BMP-2) andresponse of rat pulp to MTA and BMP-2[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2010，109(6):e103.

[5]Kang YH，Jeon SH，Park JY，et al.Platelet-rich fibrin is a bio-scaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration[J]．Tissue Eng Part A，2011，17(3-4):349.

[6]Dohan Ehrenfest DM,de Peppo G M,Doglioli P,et al.Slow release of growth factors and thrombospondin-1 in Choukroun's platelet-rich fibrin (PRF):a gold standard to achieve for all surgical platelet concentrates technologies[J].Growth Factors,2009,27(1):63.

[7]He L，Lin Y，Hu X，et al.A comparative study of platelet-rich fibrin ( PRF) and platelet-rich plasma ( PRP) on the effect of proliferation and differentiation of rat osteoblasts in vitro[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2009，108:707.

[8]Yokose S,Kadokura H,Tajima N .Platelet-derived growth factor exerts disparat e effect s on odontoblast differentiation depending on the dimers in rat dental pulp cells[ J] .Cell Tissue Res,2004 ,315(3):375.

[10]FargesJ C,Romeas A,Melin M,et al.TGF-beta1 induces accumulation of dendritic cells in the odontoblast layer[J].J Dent Res,2003,82(8):652.

[11]Melin M,Joffre-Romeas A,FargesJ C,et al.Effects of TGF-beta 1 on dental pulp cells in cultured human tooth slices[J].J Dent Res,2000,79(9):1689.

[12]崔愷,陳吉華,趙三軍.玻璃離子水門汀的研究進展[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2008,11:644.

[13]Leye Benoist F，Gaye Ndiaye F,Wakhade Kane A,et al.Evaluation of mineral trioxide aggregate ( MTA) versus calcium hydroxide cement(Dycal) in the formation of a dentine bridge:a randomized controlled trial[J].Int Dent J，2012，62(1):33.

[14]Guven EP，Yalvac ME，Sahin F，et al． Effect of dental materials calcium hydroxide-containing cement，mineral trioxide aggregate，and enamel matrix derivative on proliferation and differentiation of human tooth germ stem cells[J]． J Endod，2011，37(5):650.

收稿日期：(2013-09-27)

文章編號：1007-4287(2015)03-0363-03

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