甲狀腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達及臨床意義

張　偉，李　娟，丁　海，張學義

(撫順礦務局總醫院 病理科，遼寧 撫順113008)

甲狀腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達及臨床意義

張偉*，李娟，丁海，張學義

(撫順礦務局總醫院 病理科，遼寧 撫順113008)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0369)

自噬是一種細胞生物學過程，細胞通過內質網[1]或高爾基體[2]與溶酶體結合，降解細胞自身的陳舊蛋白及細胞器等過程，實現細胞本身代謝的需要及細胞器的更新。細胞通過自噬適應環境變化、維持內環境穩定[3，4]，得以生存或自噬性死亡。大量的研究表明，自噬活性的改變與多種腫瘤有關。Beclin-1是一種抑癌基因，它可以調節自噬水平，在腫瘤的發生、發展中起到重要作用。PTEN蛋白是和張力蛋白同源在10號染色體有缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)，近年來發現PTEN基因的缺失和突變與許多惡性腫瘤密切相關。本研究采用免疫組織化學方法檢測正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織中Beclin-1、PTEN蛋白的表達情況，探討Beclin-1蛋白、PTEN蛋白在甲狀腺癌發生、發展中的作用及相互間的關系。

1材料與方法

1.1材料隨機選取撫順礦務局總醫院2012年至2013年，手術切除的65例甲狀腺癌組織的存檔蠟塊。其中男性18例，女性47例；年齡17-62歲，平均年齡45歲，≥45歲者20例，<42歲者45例；甲狀腺乳頭狀癌32例，濾泡癌12例，髓樣癌11例，未分化癌10例；有淋巴結轉移者39例，無淋巴結轉移者26例；按2010年AJCC第七版的TNM分期標準分為：Ⅰ-Ⅱ期44例，Ⅲ-Ⅳ期21例。另隨機選取同期甲狀腺腺瘤腺葉切除術后瘤旁至少0.5 cm正常甲狀腺標本25例作為對照。每例均有詳細的臨床病理資料，所有病例術前未進行放療、化療和免疫治療。所有標本均經4%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋、切片。

1.2試劑與方法鼠抗人Beclin-1單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，鼠抗人PTEN單克隆抗體為福州邁新生物技術開發有限公司產品。采用免疫組織化學SP法對甲狀腺癌組織中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白進行檢測，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用已知陽性的切片做陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.3結果判定采用雙盲法隨機選取10個高倍視野(×400)，每個高倍視野計數100個腫瘤細胞。觀察陽性細胞所占的百分數及染色強度。對陽性細胞所占的百分數計分，以百分數<5%=0分、5%-25%=1分、26%-50%=2分、51%-75%=3分、>75%=4分。同時以染色強度無色=0分、淡黃色=1分、棕黃色=2分、深棕色=3分進行評分。最后累積積分大于3分為陽性表達，否則視為陰性表達。Beclin-1蛋白陽性顆粒為棕黃色，定位于細胞質，PTEN蛋白陽性顆粒為棕黃色，定位于細胞核。

1.4統計學分析應用SPSS18.0統計軟件包進行統計，采用卡方檢驗(χ2)及Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中的表達Beclin-1蛋白主要表達于細胞漿內(圖1)，在甲狀腺癌組織中的表達陽性率低于正常甲狀腺組織，差異有統計學意義(P<0.05)。PTEN蛋白主要表達于細胞核(圖2)，在甲狀腺癌組織中的表達陽性率低于正常甲狀腺組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1　Beclin-1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的細胞質表達

圖2　PTEN蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的細胞核表達

組別例數Beclin-1蛋白陽性例數(%)χ2值P值PTEN蛋白陽性例數(%)χ2值P值正常甲狀腺組織2520(80.00)16.56<0.0522(88.00)23.76<0.05甲狀腺癌組織6521(32.30)20(30.76)

2.2Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達與甲狀腺癌臨床病理因素的關系Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達與甲狀腺癌患者的年齡、性別、組織學類型均無明顯相關性(P>0.05)；Beclin-1蛋白的表達與甲狀腺癌有無淋巴結轉移相關(P<0.05)，PTEN蛋白的表達與甲狀腺癌的有無淋巴結轉移、TNM分期相關，隨著淋巴結轉移、TNM分期越晚，PTEN蛋白的陽性表達率降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達與甲狀腺癌臨床病理因素的關系

2.3Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中表達的相關性Spearman等級相關分析顯示，Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中的表達呈輕度正相關(r=0.21，P<0.05)。見表3。

表3　Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中

3討論

近幾年來，甲狀腺癌的發病率逐年上升，據統計2012年已排入我國惡性腫瘤發病率的前十名。甲狀腺癌起病隱匿，預后很好，經過規范治療，即使有頸部淋巴結轉移，其5年生存率可達到97%；但是已有遠處轉移者，則預后較差。早期診斷并規范治療才能保證甲狀腺癌的最佳預后。本研究通過Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中的表達情況進行分析，了解二者在甲狀腺癌的發生、發展過程中的作用機制，為甲狀腺癌的早期診斷、判斷預后及生物靶向治療提供參考的依據。

Beclin-1是一種與抑癌基因，與酵母菌Atg6同源，是第一個被發現的參與自噬過程的基因，是由Liang等[5]于1998年被發現并命名，1999年由Aita等[6]成功克隆，該基因位于人類染色體17q21上，有12個外顯子，11個內含子。適度的自噬可以使細胞得以生存，過度自噬則引起細胞的自噬性死亡。Beclin-1蛋白在細胞自噬過程中起到重要作用，研究表明，Beclin-1蛋白在肺癌[7]、卵巢癌[8]、腦瘤[9]中低表達，在胃癌[10]、肝癌[11]中高表達，Beclin-1蛋白在不同的腫瘤細胞中發揮不同的作用。本研究結果顯示Beclin-1蛋白在甲狀腺癌中的表達低于正常甲狀腺組織，并且在有淋巴結轉移組的表達低于無淋巴結轉移組，提示Beclin-1蛋白與甲狀腺癌的發生、發展相關，其機制可能為：Beclin-1蛋白的表達下調，降低細胞的自噬反應，不能夠誘導自噬性腫瘤細胞死亡，從而促進腫瘤的發生和發展；Beclin-1蛋白可以通過促進細胞的凋亡，對腫瘤起到抑制的作用；Beclin-1蛋白還可以影響VEGF和HIF-2α，抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和腫瘤新血管的生成，阻止腫瘤的進展。

PTEN是一種抑癌基因，亦稱MMAC1或TEP1。是1997年由Li等[12]克隆并命名的，是目前唯一一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在細胞凋亡、細胞增殖、細胞遷移過程中起到重要作用[13]。本研究結果顯示PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中的表達陽性率低于正常甲狀腺組織，提示其在甲狀腺癌的發生過程中起重要作用，機制可能為PTEN蛋白誘導細胞周期的阻滯，通過PI3K途徑和MAPK途徑來調控細胞周期[14-15]，使細胞無限增殖，形成腫瘤[16]；PTEN基因的突變可以導致AKT通路的激活和抑制細胞的自噬[17]，促進腫瘤的發生。本研究結果還顯示PTEN蛋白在甲狀腺癌中的表達隨著淋巴結轉移、TNM分期越晚PTEN蛋白的陽性表達率降低。與國內李茂竹等[18]研究一致，提示PTEN蛋白與甲狀腺癌的發展密切相關，其機制可能為PTEN蛋白使FAK去磷酸化，阻止腫瘤細胞的侵襲和轉移[19]，PTEN蛋白可以調節FAK和Shc的磷酸化，對細胞間及細胞與細胞外基質間的相互作用進行調控，影響腫瘤細胞的粘連和轉移[20]。

Beclin-1和PTEN都是抑癌基因，都能夠在腫瘤的發生和發展過程中起到阻抗作用，本研究發現二者在甲狀腺癌中的表達成正相關，與李捷等[21]的研究一致。提示甲狀腺癌的進展過程中存在內在聯系，PTEN蛋白是ClassI PI3K活性的的負調控因子，可水解3，4，5一三磷酸肌醇，使有PH同源結構域的絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT(也稱PKB)被脫磷酸化而活化，降低 PKB/AKT 的磷酸化水平，解除ClassI PI3K/PKB的抑制作用，促進自噬的發生。Beclin-1蛋白和PTEN蛋白共同參與細胞的自噬，可能分別在自噬體形成和信號調控水平來進行調節，在甲狀腺癌的發生、發展中發揮作用。

綜上所述Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌的發生、侵襲和轉移密切相關，二者聯合檢測，可以作為評估甲狀腺癌預后的指標。 深入研究二者在細胞自噬及甲狀腺癌中的作用機制，為甲狀腺癌的靶向治療提供理論依據。

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摘要：目的探討Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌中的表達及其臨床意義。方法采用免疫組織化學SP法檢測65例甲狀腺癌及25例正常甲狀腺組織中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達，并對其與性別、年齡、病理學分型、TNM分期及淋巴結轉移的關系進行分析。結果65例甲狀腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的陽性表達率均低于二者在正常甲狀腺組織中的表達，差異具有統計學意義(P<0.05)。在甲狀腺癌中Beclin-1蛋白在伴淋巴結轉移組陽性率20.5%低于不伴淋巴結轉移組50.0%；PTEN蛋白在伴淋巴結轉移組陽性率20.5%低于不伴淋巴結轉移組46.2%；在TNM為Ⅲ、Ⅳ期組陽性率14.3%低于Ⅰ、Ⅱ期組的陽性率38.6%(P<0.05)。Beclin-1蛋白和PTEN蛋白表達之間呈正相關。結論Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的低表達與甲狀腺癌的發生、發展相關，二者聯合標記可能作為評估甲狀腺癌惡性程度及預后的有效指標，并可能為其靶向治療提供思路。

關鍵詞：甲狀腺癌；Beclin-1蛋白；PTEN蛋白； 免疫組織化學

Expression and clinical significance of Beclin-1 and PTEN proteins in thyreoid carcinomaZHANGWei，LIJuan，DINGHai，etal.(DepartmentofPathology，GeneralHospitalofFushunMiningBureau,Fushun113008，China)

Abstract:ObjectiveThe study investigated the expressions and significance of Beclin-1 and PTEN proteins in thyreoid carcinoma.MethodsThe expressions of Beclin-1 and PTEN proteins were detected in 65 cases of thyroid carcinoma and 25 cases of normal thyroid tissues by immunohistochemistry(streptavidine-peroxidase method)，and meanwhile，compared with sex，age，pathology subtypes，TNM stages and lymph node metastasis of thyroid carcinoma.ResultsThe expression rate of Beclin-1 and PTEN proteins in thyroid carcinoma was significantly lower than that in normal thyroid tissues，and the difference was statistically significant(P<0.05)；The positive expression rate of Beclin-1 protein in the patients with lymph node metastasis(20.5%)was significantly lower than those without lymph node metastasis(50.0%);The positive expression rate of PTEN protein in the patients with lymph node metastasis20.5%was significantly lower than those without lymph node metastasis46.2%;TNM stage Ⅲ、Ⅳ14.3% was significantly lower than TNM stage Ⅰ、Ⅱ38.6%(P<0.05),The expressions of Beclin-1 protein was positively correlated to that of PTEN protein in thyreoid carcinoma.ConclusionThe down-regulation of Beclin-1 and PTEN proteins may be associated with thyroid carcinoma．Joint marking these two genes may offer a effective reference for evaluation of malignant degree and prognosis of thyroid cancer and may even afford a mentality to the targeted therapy．

Key words:thyreoid carcinoma;Beclin-1 protein;PTEN protein;immunohistochemistry

收稿日期：(2014-03-09)

作者簡介：張偉(1974-)，男，遼寧錦縣人，副主任醫師，碩士學位，研究方向：腫瘤病理學研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R736.1

文章編號：1007-4287(2015)03-0369-04

通訊作者*