甲狀腺癌患者血漿miR-221的表達(dá)及臨床意義

甲狀腺癌患者血漿miR-221的表達(dá)及臨床意義

徐升強(qiáng)

(武漢市第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,湖北 武漢430022)

本研究擬定量檢測(cè)乳頭狀甲狀腺癌患者外周血中miR-221水平，分析其作為乳頭狀甲狀腺癌生物標(biāo)志物的可行性。

1材料和方法

1.1標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)共收集本院住院部53例乳頭狀甲狀腺癌患者，33例甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者，另外50例排除各種腫瘤的健康志愿者用于對(duì)照。所有納入研究的個(gè)體都簽署了知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)均經(jīng)由病理切片診斷。乳頭狀甲狀腺癌患者男5例，女48例，平均年齡38.6±6.9歲。甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者男6例、女27例，平均年齡40.2±7.3歲。健康對(duì)照組男15例，女35例，平均年齡37.4±8.2歲。清晨采集患者外周血2 ml，EDTA抗凝，3 000 g離心5 min，上清微量離心管再次12 000 g離心10 min，上清保存于-80℃?zhèn)溆?。所有?biāo)本采集后4 h內(nèi)處理完畢。

1.2MiRNA提取

采用miRcute miRNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)公司，北京)按照說(shuō)明書進(jìn)行抽提血漿miRNA。400 μl血漿與等量的變性液混勻后加入5 μl合成的cel-miR-39(5fmol/μl)。Cel-miR-39被用于操作過(guò)程中的內(nèi)參。最后用30 μl無(wú)RNA酶的水溶解miRNA。

1.3逆轉(zhuǎn)錄

用miRcute miRNA 單鏈cDNA合成試劑盒(天根生物技術(shù)公司，北京)合成miRNA的cDNA。加A反應(yīng)在20 μl體系中進(jìn)行：11.6 μl無(wú)RNA酶ddH2O，2 μl 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.4 μl Poly(A)聚合酶(5 U/μl)，4 μl 5×rATP溶液，2 μl miRNA?；靹蚝?7℃反應(yīng)60 min。取2 μl反應(yīng)物用于逆轉(zhuǎn)錄，其余保存于-80℃。逆轉(zhuǎn)錄同樣在20 μl體系中進(jìn)行：11.5 μl 無(wú)RNA酶的ddH2O，1 μl RNasin(40 U/μl)，2 μl 10×RT緩沖液，2 μl 10×RT引物，1 μl dNTP混合物(每種2.5 mM)，0.5 μl Quant RTase，2 μl Poly(A)反應(yīng)產(chǎn)物。混勻后37℃反應(yīng)60 min。合成的cDNA保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4定量RT-PCR分析

在20 μl體系中進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：7.2 μl ddH2O，10 μl 2×miRcute miRNA 預(yù)混液(含SYBR和ROX)，0.4 μl逆轉(zhuǎn)錄引物(10 μM)，0.4 μl前向引物(10 μM)，2 μl cDNA。混合物被均分為兩份。反應(yīng)條件為：94℃ 2 min預(yù)變性后，40個(gè)循環(huán)于94℃ 2 s，60攝氏度34 s。反應(yīng)在ABI step-one儀器上進(jìn)行，儀器自動(dòng)設(shè)定循環(huán)閾值(Ct)。miR-221的特異引物： GGGAGCTACATTGTCTGCTGGTTTC； U6b特異引物：ACGCAAATTCGTGAAGCGTT，cel-miR-39特異引物:CACCGGGTGTAAATCAGCTTG。B6b和cel-miR-39被用作內(nèi)參。根據(jù)Tomasetti’s的描述，ΔCTmiR-221=CTmiR-221-CTU6b-CTcel-miR39，ΔCTmiR-221越高miR-221水平越低。SLE患者較正常對(duì)照miR-221的相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCT表示。每個(gè)定量反應(yīng)設(shè)置復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

miR-221的表達(dá)方式為均值±SD。通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)兩組間均值進(jìn)行比較。受試者工作曲線(ROC)分析診斷效率。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1miR-221在各研究組中的水平

乳頭狀甲狀腺癌患者組miR-221水平顯著高于正常對(duì)照組[-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) versus -29.33±3.23(95%CI:-28.55—30.67),P=0.038]。乳頭狀甲狀腺癌患者組miR-221平均水平約為正常對(duì)照組的3.71倍。乳頭狀甲狀腺癌患者miR-221水平與甲狀腺良性結(jié)節(jié)，甲狀腺良性結(jié)節(jié)與正常對(duì)照的比較情況見圖1。

2.2miR-221在甲狀腺手術(shù)前后的水平

比較乳頭狀甲狀腺癌手術(shù)前及術(shù)后一周血漿中miR-221水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者血漿miR-221水平顯著下降[術(shù)前-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) vs 術(shù)后-33.33±3.86(95%CI:-31.43—35.32),P=0.022]，手術(shù)后一周血漿miR-221水平下降約4.06倍(圖2)。

2.3miR-221對(duì)乳頭狀甲狀腺癌的診斷評(píng)價(jià)

ROC曲線下面積為0.75±0.06 (95%CI:0.63-0.88,P=0.01)(圖3)。當(dāng)miR-221檢測(cè)以ΔCT=-30.27為臨界值時(shí)，其敏感度為75.9%，特異度為62.1%。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值66.7%，陰性預(yù)測(cè)值72.0%。

圖1血漿miR-221在各研究組間的水平。 圖2乳頭狀甲狀腺癌手術(shù)前后血圖3血漿miR-221對(duì)乳頭狀甲狀腺癌

乳頭狀甲狀腺癌患者血漿miR-221漿miR-221水平。乳頭狀甲診斷作用的ROC分析

水平顯著高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健狀腺癌患者血漿miR-221水

康對(duì)照(P<0.05)，甲狀腺良性結(jié)節(jié)平手術(shù)后顯著下降(P<0.05)

患者與健康對(duì)照血漿miR-221水平

無(wú)顯著差異(P>0.05)

3討論

本研究中，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)乳頭狀甲狀腺癌患者血漿循環(huán)miR-221的水平。我們發(fā)現(xiàn)與甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康對(duì)照者相比，乳頭狀甲狀腺癌患者血漿miR-221水平顯著增高(P<0.01)，手術(shù)后此miRNA水平顯著下降(P<0.01)。乳頭狀甲狀腺癌術(shù)后、甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康對(duì)照者血漿miR-221水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

人miR-221定位于X染色體，其序列在各物種間高度保守。已有的研究發(fā)現(xiàn)miR-221在不同的腫瘤發(fā)病中具有不同的作用，在一些腫瘤中起抑制作用而在另一些腫瘤中則可能起刺激作用。細(xì)胞周期調(diào)劑蛋白p27 Kip1的編碼基因被認(rèn)為是miR-221的一個(gè)靶點(diǎn)，在胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳腺癌、肝癌及肺癌細(xì)胞中， miR-221與p27 Kip1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[5-7]，說(shuō)明miR-221參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。miR-221在腫瘤細(xì)胞中可以同時(shí)調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)從而達(dá)到對(duì)腫瘤發(fā)生協(xié)同刺激作用[8]。

自從發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA在外周血中可以穩(wěn)定存在，miRNA已被作為生物標(biāo)志物進(jìn)行廣泛的研究。miRNA作為生物標(biāo)志物具有多種優(yōu)點(diǎn)[9]：①比mRNA穩(wěn)定。miRNA在血漿中能夠被較長(zhǎng)時(shí)間的保存，并且對(duì)反復(fù)凍融等苛刻條件不敏感。②利于檢測(cè)。當(dāng)前對(duì)miRNA的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)比較成熟。較之對(duì)蛋白等生物標(biāo)志物的檢測(cè)，能夠通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的生物標(biāo)志物具有更高的診斷敏感度和特異度。③miRNA在體內(nèi)的功能十分豐富，對(duì)其進(jìn)行高通量的定量分析，有利于及早全面了解機(jī)體健康狀況。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)乳頭狀甲狀腺癌組織中高表達(dá)miR-221。至今尚未見到miR-221作為乳頭狀甲狀腺癌患者血漿生物標(biāo)志物。本研究中，我們檢測(cè)了乳頭狀甲狀腺癌患者血漿循環(huán)miR-221水平，發(fā)現(xiàn)miR-221在乳頭狀甲狀腺癌患者血漿中高表達(dá)(P<0.01)。血漿miR-221對(duì)乳頭狀甲狀腺癌具有中等強(qiáng)度的診斷效能(AUC=0.75±0.06)。

總之，本研究檢測(cè)了乳頭狀甲狀腺癌患者手術(shù)前后、甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康人血漿miR-221水平，分析其作為乳頭狀甲狀腺癌生物標(biāo)志物的特性。我們的數(shù)據(jù)提示miR-221在乳頭狀甲狀腺癌患者血漿中高表達(dá)。對(duì)乳頭狀甲狀腺癌具有中等強(qiáng)度的診斷效能，進(jìn)一步可聯(lián)合其他乳頭狀甲狀腺癌的生物標(biāo)志物來(lái)提高血漿miR-221對(duì)乳頭狀甲狀腺癌的診斷效能。

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收稿日期：(2013-11-12)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)03-0421-03