4種脂肪酶檢測系統的性能評價

安崇文，李海霞

(北京大學第一醫院 檢驗科，北京100034)

4種脂肪酶檢測系統的性能評價

安崇文，李海霞*

(北京大學第一醫院 檢驗科，北京100034)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0001)

近年來,國外研究資料表明在急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)的診斷上血脂肪酶(Lipase,LPS)是一個比血淀粉酶(Amylase,AMY)更為敏感和特異的指標[1-3]。美國胃腸病學會在對AP診斷的實踐指南規定中，已將血LPS列入其中，并指出血LPS濃度應超過正常參考上限3倍[4]。然而目前我國尚未將血LPS納入AP的診斷標準中[5]，但國內早已有大量文獻報道[6，7]，血LPS在診斷AP上敏感性為90%，特異性為93%，ROC曲線下面積(AUC)為0.956，均優于AMY。隨著對LPS臨床應用的廣泛普及，已有越來越多的試劑廠家研發出LPS檢測試劑，國內市場銷售的LPS試劑盒眾多,產品質量是否符合實驗室要求有待驗證，為此本研究選取了目前我國臨床實驗室在全自動生化儀上測定LPS的4種酶比色法檢測系統進行評價，證實其是否能滿足預期實驗室需求。

1材料與方法

1.1　儀器試劑與樣本準備

1.1.1檢測系統4種檢測系統分別用A、B、C、D表示，均為非配套系統，應用日立HITACHI 7600-110全自動生化分析儀，檢測系統試劑、校準液如表1。

表1　檢測系統來源詳情

1.1.2比對標本選取2013年3月12日至16日期間北京大學第一醫院住院患者樣本40份，其LPS濃度覆蓋整個可報告范圍，應無黃疸、溶血、乳糜等干擾物。

1.1.3輔助試劑生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液，批號1107014W)購自北京雙鶴藥業公司；血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)干擾物(批號：TR064)、膽紅素(Bilirubin,Bil)干擾物(批號：AM552)、三酰甘油(Triglyceride,TG)干擾物批號：DJ604)由日立和光純藥工業株式會社提供。

1.2評價方法參考美國臨床實驗室標準化組織(Clinical and Laboratory Standards Institude,CLSI)評價方案對試劑的性能進行評價。

1.2.1精密度評估即不精密度實驗，參考EP5-A2文件[8]，選取低、高LPS濃度的混合血漿兩份(約25 U/L、240 U/L)，無黃疸、溶血、乳糜等干擾物，-20℃冰箱凍存。每天測定2批，2批間隔>2 h，每批重復測定2次，連續測定20 d，計算批內、批間變異系數(coefficient of variation,CV)及95%可信區間。

1.2.3回收試驗選擇LPS低值血漿1份(約27U/L)，D、A、C系統的校準液(35U/L、77.1U/L、102U/L)各1份，將其制備成基礎樣本、低回收樣本、中回收樣本、高回收樣本；同時測定3次，取均值，計算低、中、高樣本的回收率，以回收率(100±10)%為評判標準。

參考文獻1.2.4抗干擾性評估[12-14]和EP7-A2文件[15]提供的方案并進行部分調整后，收集低、高LPS濃度混合血漿兩份，應無黃疸、溶血、乳糜等干擾物；加入干擾物質的最高濃度參考臨床病理樣本可能出現的最高含量以及試劑說明書的說明,分別在上述血漿中加入Hb、Bil、TG干擾物，配制成Hb終濃度為5、10、15 g/L，Bil終濃度為300、400、500、600 μmol/L，TG終濃度為8、10、15、20 mmol/L的樣本，對照樣本加入等體積生理鹽水，同時測定2次，取均值，以偏倚<±10%做為可接受標準。

1.2.5分析測量范圍(AMR)評估即線性實驗，參考EP6-A文件[16]，選取濃度為0U/L的校準液做為低值樣本，選取高LPS血漿做為高濃度樣本，將L和H樣本按：8L，7L+1H，6L+2H，5L+3H，4L+4H，3L+5H，2L+6H，1L+7H，8H進行一系列稀釋混勻后測定，應用空白樣本隔開待測樣本，以防攜帶污染，測定4次，求其均值，對數據進行多項式回歸統計分析，判斷非線性系數b2和b3與0比較差異是否具有統計學意義。若b2和b3或b2和b3無統計學意義，則認為存在線性關系，此范圍即為AMR。

1.2.7統計學分析采用MicrosoftExcel2003，SPSS13.0軟件，Medcalc11.6.1軟件。回歸分析采用Passing-Bablok回歸，回歸線性檢測采用Cusum方法，P<0.05表示差異具有統計學意義；相關分析采用Pearson相關，P<0.05表示差異具有統計學意義；偏差分析應用Bland-Altman差異分析法。

2結果

2.1　精密度評估

表2顯示4種LPS檢測系統的批內、批間變異，基于生物學變異設定的總允許誤差(TEa：<37.88%)[18-20]，批內CV均≤TEa的1/4(9.47%)，批間CV均≤TEa的1/3(12.63%)。

表2　4種系統的批內、批間精密度

注：括號內的數字表示95%可信區間

2.2　正確度評估

表3顯示4種系統測定美國CAP室間質評物的結果，基于生物學變異設定的總允許誤差(TEa：<37.88%)、允許偏倚(<11.31%)[18-20]，僅A、C系統較為理想，其95%驗證區間包含了指定均值(CAP Roche Hitachi system mean)，且符合生物學變異設定的總允許誤差和允許偏倚，此實驗數據可證實其真實度。

表3　4種系統測定CAP室間質評物結果(U/L)

注：括號內的數字表示相對偏差(%)

2.3　回收試驗結果

表4顯示4種系統的回收率結果，除B系統高回收標本，其它均未超出(100±10)%。

2.4　抗干擾性評估

圖1顯示Hb≥5 g/L時，對B、C系統低水平有超出10%的正干擾，在15 g/L時，對D系統低水平有超出10%的正干擾；Bil≤600 μmol/L時對4種系統均無明顯干擾現象；TG≥8 mmol/L時，對A、C系統均有超出10%的負干擾。

表4　4種系統回收率的結果

注：右上帶*數據為超出(100±10)%

注：○代表A系統，□代表B系統，△代表C系統，◇代表D系統

2.5　AMR驗證

對數據進行二元一次、二元二次和二元三次多項式回歸分析，A系統的多項式回歸方程分別為YA=-68.333+68.786X、YA=-71.250+70.973X-0.312X2(P=0.604)、YA=-56.667+52.628X+5.764X2-0.579X3(PX2=0.203、PX3=0.186);B系統的多項式回歸方程分別為YB=-61.667+62.4X、YB=-68.690+66.231X-0.383X2(P=0.099)、YB=-57.802+55.804X+2.092X2-0.165X3(PX2=0.096、PX3=0.058);C系統的多項式回歸方程分別為YC=-63.056+67.567X、YC=-79.881+76.744X-0.918X2(P=0.061)、YC=-57.603+55.411X+4.145X2-0.338X3(PX2=0.099、PX3=0.055);D系統的多項式回歸方程分別為YD=-63.286+63.5X、YD=-64.714+64.452X-0.119X2(P=0.606)、YD=-58.714+57.619X+1.881X2-0.167X3(PX2=0.284、PX3=0.257)；對非線性系數b2和b3進行t檢驗，概率P均 >0.05，b2和b3與0比較差異無統計學意義，4種系統的最佳擬合方程為二元一次多項式(圖2)，則認為4種系統存在線性關系，評價的濃度分別為0.5～341、0～494、0～529、0～379 μmol/L。

注：○表示觀測值，—表示一次多項式，—- - -表示二次多項式，- - -表示三次多項式(4個小圖分別代表A、B、C、D的線性分析)

2.6　比對結果

綜合以上性能，選取檢測性能較為理想的C系統為參考對象。實驗中超出AMR數據不計入相關統計，A、B、D與C系統的相關性較好，r分別為0.998、0.997、0.985，均>0.975 (n =80,P<0.01)；與C系統比較的回歸方程分別為YA=-4.32+ 0.957X、YB=5.894+ 0.778X、YD=2.781+0.796X，斜率(b)95%可信區間分別為0.9197～1.0025、0.7434～0.8020、0.7764～0.8125，截距(a)95%可信區間分別為-6.4033～0.1941、4.0040～7.6996、1.5007～4.5862，線性回歸的Cusum檢驗P >0.05；偏差分析顯示A、B、D系統平均絕對偏差分別為-9.7、-21.7、-21.1U/L,平均相對偏差分別為-10.12%、-11.96%、-13.51%。表5顯示A、B、D系統在醫學決定水平時的預期偏差，B、D系統在Xc=180U/L時，允許偏差不在預期偏差的可信區間內且小于可信區間下限，證實B、D系統在Xc=180U/L時與C系統的性能不相當，結果可比性差，不可接受。

表5　在醫學決定水平處預期偏差可接受性評估表(U/L)

3討論

酶比色法測定LPS的主要原理是：在堿性環境中，脂肪酶在共脂肪酶和膽汁酸的存在下水解人工合成的底物—1,2-鄰-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基試鹵靈)酯(簡稱：6-甲基試鹵靈酯)，生成1,2-鄰-二月桂基-消旋-甘油和一個不穩定的中間體戊二酸-(6-甲基試鹵靈酯)，該中間體在堿性條件下，自發降解，生成戊二酸和甲基試鹵靈。甲基試鹵靈是一個紅色顯色團，在波長570 nm處有吸收峰，顯色的強度直接與樣本中的LPS活性呈正比[21]。

本研究評價的4種LPS酶比色法檢測系統的精密度均符合生物學變異設定的質量規范。正確度實驗顯示：僅A、C系統較為滿意，結果均在可接受范圍內，95%驗證區間包含了其指定均值，分析原因可能與CAP賦予的靶值有一定關系，因為CAP室間質評結果的靶值統計是采用所有參與實驗者的方法學分組計算中位數的方法，B、D系統的準確性欠佳，與靶值偏差大。4種系統對膽紅素均有較強的抗干擾能力，其中A系統對Hb的抗干擾能力較強；B、D系統TG≤20 mmol/L時無明顯干擾，抗干擾能力較強。AMR實驗結果顯示：B、C較A、D系統線性寬。相關分析以選擇上述性能較為理想的C系統為參考對象，A、B、D與C系統的相關性較好，r均>0.975 (n=80,P<0.01)；偏差分析顯示A系統絕對偏差為-9.7 U/L、相對偏差為-10.12%，相對較小。整體來看4種系統之間存在一定偏差，可能由于各系統中校準品溯源不統一，校準品賦值不明確且存在差異，造成產品差異較大。

綜上所述，4種檢測系統的性能之間存在差異。因此在臨床應用中，實驗室應選用分析性能優越的檢測系統，通過參加室間質評或其它渠道驗證其正確度。

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摘要：目的評估4種脂肪酶(Lipase,LPS)檢測系統的分析性能。方法方法學評價研究。應用美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)EP5-A2、EP15-A2、EP7-A2、EP6-A、EP9-A2方法驗證4種脂肪酶檢測系統的精密度、正確度、抗干擾性、分析測量范圍(AMR)、相關及偏差。采用美國病理學家協會(CAP)發放的室間質評物(C-A和C-B)驗證不同系統檢測LPS正確度。回歸分析采用Passing-Bablok檢驗，回歸線性檢測采用Cusum方法，相關分析采用Pearson檢驗，偏差分析應用Bland-Altman曲線。結果LPS在25-240 U/L時，4種檢測系統的批內CV均10%的正干擾，在15 g/L時，對D系統低水平有>10%的正干擾；Bil≤600 μmol/L時對4種系統均無明顯干擾現象；TG≥8 mmol/L時，對A、C系統均有>10%的負干擾。4種系統AMR上限分別為341、494、529、379 U/L。相關分析以選取上述性能較為理想的C系統為參考對象，A、B、D與C系統比較相關性較好，r均>0.975 (P<0.01)，Bland-Altman偏差分析顯示平均絕對偏差分別為-9.7、-21.7、-21.1 U/L,平均相對偏差分別為-10.12%、-11.96%、-13.51%，計算醫學決定水平(Xc)時的預期偏差顯示在Xc=60 U/L時，A、B、D系統均符合生物學變異設定的1/3總允許誤差(12.63%)，在Xc=180 U/L時，B、D系統的允許偏差不在預期偏差的可信區間內且小于可信區間下限，證實B、D系統在Xc=180 U/L時與C系統的性能不相當，結果可比性差，不可接受。結論4種檢測系統的性能之間存在差異。

關鍵詞：脂肪酶；酶比色法；全自動生化分析儀

Performance evaluation of four lipase detection systemsANChong-wen,LIHai-xia.(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the performance for four Lipase(LPS)analysis system.MethodsThis study belongs to the methodological evaluation study,Analysed four Lipase systems and their correlation and deviation compared with A system.Precision,accuracy,anti-interference,analytical measuring range (AMR) were evaluated,according to the CLSI EP5-A2,EP15-A2,EP7-A2,EP6-A,EP9-A2 guidelines.To assess the accuracy,we used the EQA samples(C-A and C-B)from CAP.Regression using Passing-Bablok,linear regression was detected by Cusum method,analysis of correlation using pearson,analysis of deviation using Bland-Altman.ResultsFor four lipase detection systems,the within-run CVs were all <1/4TEa(9.47%)and the between-run CVs were all <1/3TEa(12.63%)when the concentration of LPS was 25-240 U/L.The accuracy verification testing CAP EQA material showed that A and C system results met the desirable,the 95% verification interval that contains the specified mean value,and in accordance with the total allowable error derived from biological variation set (TEa:<37.88%);Recovery test shows that except for the high recovery of specimens from B system,other systems were not exceed±10%.Anti-interference analysis showed that had over 10% positive interference on the low level of B、C system while Hb≥5 g/L and on the low level of D system when Hb was 15 g/L;There was no significant interference for the four systems when Bil≤600 μmol/L.It had over 10% negative interference of A、C system while TG ≥8 mmol/L;The upper limits of AMR for A,B,C and D system were 341,494,529 and 379 U/L respectively.Correlation analysis to select the C system the performance of ideal as the reference object,the A,B,D system correlation well with C system and the pearson correlation coefficient(r)>0.975 (P< 0.01);Compared with C system,the Bland-Altman results showed that the average absolute deviation were -9.7、-21.7、-21.1 U/L and the average relative devation were -10.12%、-11.96%、-13.51% respectively for the A,B,D system.By calculating expected deviation of medical decision level (Xc) showed that A,B,D systems were in line with 1/3 total allowable error (12.63%) of the biological variation set when Xc=60 U/L,the allowable deviation of B,D systems were not in the confidence interval (CI) and also less than the lower limit of the confidence interval from expected deviation when Xc=180 U/L,and performance of B,D system by verified was not quite compared with the C system when the Xc=180 U/L,comparability of the results was difference and unacceptable.ConclusionThere are differences between the performance of the four lipase detection system.

Key words:Lipase;Enzyme colorimetry;Automatic biochemical analyzer

收稿日期：(2014-04-25)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R446.11+2

文章編號：1007-4287(2015)01-0001-06

通訊作者*

基金項目：國家科技支撐計劃基金資助項目(2012BAH24F00)