鋅對脊髓缺血再灌注損傷大鼠ATP酶、MAO活性和T-AOC含量影響的研究

劉　磊，孟春陽，李　鵬，李　雷，王永杰，尹　飛*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033；2.吉林大學公共衛生學院 衛生毒理教研室,吉林 長春130021)

鋅對脊髓缺血再灌注損傷大鼠ATP酶、MAO活性和T-AOC含量影響的研究

劉磊1，孟春陽1，李鵬2，李雷2，王永杰2，尹飛1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033；2.吉林大學公共衛生學院 衛生毒理教研室,吉林 長春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0010)

脊髓缺血再灌注損傷(SCII)是指在脊柱外科和胸腹主動脈等手術過程中導致脊髓缺血，引起脊髓的損傷。缺血的脊髓組織在血液恢復灌注后其結構和功能不僅未能恢復，反而會導致損傷加重[1]。脊髓缺血再灌注損傷是胸腹主動脈手術和脊柱外科的嚴重并發癥之一，大約40%的病人會發生患癱[2]。目前針對脊髓缺血再灌注損傷的治療方法主要有缺血預適應、藥物治療低溫保護術等，雖然這些治療對脊髓缺血再灌注損傷具有一定的作用，但是療效并不顯著。因此，如何減輕或避免脊髓缺血再灌注損傷成為人們關注和亟待解決的重點。

相關研究表明，鋅是機體的必需微量元素 是機體多種酶的必要成分或活化因子，參與多種信號通路的轉導，具有抗炎癥、抗氧化和抗纖維化等作用[3,4]。但有關鋅在脊髓缺血再灌注損傷的保護作用機制報道較少。本實驗目的是探討鋅離子對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用的可能作用機制，從而為鋅離子在臨床的應用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1主要試劑硫酸鋅、ATP酶測定試劑盒、單胺氧化酶(MAO)測定試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(購自為南京建成生物工程研究所)。

1.1.2實驗動物選擇健康清潔級Wistar大鼠60只，體重(200±20)g，購自吉林大學實驗動物中心，合格證號：SCXK-(吉)：2007-0003。

1.2　實驗方法

1.2.1動物分組及處理 將60只Wistar大鼠隨機分為5組，每組12只，雌雄各半，分別為假手術組、模型組、硫酸鋅預處理高劑量組(100 mg/kg)、中劑量組(50 mg/kg)和低劑量組(25 mg/kg)。各劑量組每日灌胃給予硫酸鋅1次，假手術組和模型組給予相同劑量生理鹽水。連續灌胃7天，第8天制備脊髓缺血再灌注損傷動物模型，損傷后24h測定脊髓組織中ATP酶、MAO活性和T-AOC含量。

1.2.2脊髓缺血再灌注損傷模型制備 連續灌胃給藥7天后，第8天用2%戊巴比妥鈉按45 mg/kg對大鼠進行腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥位固定于手術臺上，碘伏消毒大鼠腹部，并沿大鼠腹中線切開皮膚，在腹腔內找到左腎，沿左腎動脈向近心端尋找到腹主動脈，并鈍性分離，同時取用動脈夾夾閉腹主動脈，45 min后打開動脈夾，血液恢復再灌注。術后采用青霉素預防感染。假手術組只開腹，游離出腹主動脈后不進行夾閉[5,6]。再灌注24 h后取缺血區脊髓組織，稱重。

1.2.3神經功能評分再灌注后24 h后，采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)運動功能評分法對脊髓缺血再灌注損傷模型進行后肢神經功能評分并記錄。

1.2.4ATP酶、MAO活性和T-AOC含量的檢測采用紫外分光光度法測定脊髓的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，脊髓的總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，T-AOC)和單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)活性的變化。試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品，完全按照試劑盒說明書測定步驟進行檢測。

1.3　數據處理與分析

2結果

2.1　各組大鼠Tarlov評分結果

造模后，模型組出現不同程度的后肢神經功能缺陷。鋅組好于模型組。與假手術組比較模型組大鼠神經功能評分顯著低于假手術組(P<0.05)。與模型組比較，各給鋅組大鼠神經功能評分明顯高于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)，結果見表1。

表1　不同組大鼠神經功能評分結果

注：P<0.05，與假手術組比較；▲P<0.05，與模型組比較

2.2　鋅離子對大鼠脊髓的ATP酶活性的影響

各組大鼠脊髓組織Na+-K+-ATP酶活性差異具有統計學意義(P<0.05)，經兩兩比較，各硫酸鋅處理組Na+-K+-ATP酶活性明顯低于假手術組(P<0.05)，但明顯高于模型組(P<0.05)。模型組和各硫酸鋅處理組脊髓組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于假手術組，差異具有著性(P<0.05,見表2)。

表2　鋅離子對大鼠脊髓的ATP酶活性的

注：*P<0.05，與假手術組比較；▲P<0.05，與模型組比較

2.3　鋅離子對大鼠脊髓組織MAO活性的影響

各組大鼠脊髓組織中MAO活性的差異具有統計學意義(P<0.05)，模型組和各硫酸鋅處理組大鼠脊髓組織內的MAO活性均顯著高于假手術組(P<0.05)，且100 mg/kg/d 硫酸鋅處理組MAO活性明顯低于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)，見表3。

表3　鋅離子對大鼠脊髓組織MAO活性的

注：*P<0.05，與假手術組比較；▲P<0.05，與模型組比較

2.4　鋅離子對大鼠脊髓組織T-AOC含量的影響

各組大鼠脊髓組織中T-AOC含量差異具有統計學意義(P<0.05)，模型組和各硫酸鋅處理組大鼠脊髓組織內的T-AOC含量顯著低于假手術組(P<0.05)。模型組大鼠脊髓組織中T-AOC含量最低，隨著硫酸鋅劑量的增加，T-AOC含量呈上升趨勢，見表3。

3討論

脊髓缺血再灌注損傷是一種多因素的病理生理過程，涉及細胞凋亡、能量代謝、脂質過氧化、自由基生成增加、細胞內鈣超載、興奮性毒性產物增加等多個方面[7]，具體的作用機制尚不清楚。脊髓缺血再灌注損傷可以導致截癱，甚至死亡，嚴重威脅著人類的健康和生命。脊髓缺血再灌注損傷在臨床上尚無有效的治療方法。因此，尋求一種在臨床迫切需要尋找一種使用方便，并能對脊髓損傷的治療有效的藥物。

鋅作為機體必需的微量營養元素，其水平的提高有利于酶活性的提高。同時，鋅對細胞保護作用的主要途徑是抑制過氧化作用。其作用機理可能是競爭性結合膜蛋白上的巰基，并抑制其氧化形成二硫鍵，從而控制脂質過氧化反應，保護細胞膜的穩定性[8]。

本研究結果顯示，各硫酸鋅處理組Na+-K+-ATP酶活性明顯低于假手術組，但明顯高于模型組，差異具有統計學意義。模型組和各硫酸鋅處理組脊髓組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于假手術組，差異具有著性。隨著硫酸鋅濃度的增加，各組大鼠脊髓組織中Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈逐漸增加的趨勢。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)可以反映生物體的新陳代謝狀況；通過檢測ATP酶的變化，可間接反映各個臟器的功能狀態以及生物體的新陳代謝狀況。ATP酶存在于組織細胞及細胞器膜上的一種蛋白質，在物質的運輸、能量轉換以及信息傳遞等方面都具有重要作用。ATP是生物體各種生物活動所需能量的直接來源，ATP酶是用來水解ATP為生命活動提供能量的酶，主要分為Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶。脊髓組織所需能量主要來源于ATP，當脊髓組織發生病變時，其相應的ATP酶活力可能出現異常。通過恢復缺血部位的ATP水平、減少ATP的消耗，則能夠維持能量供應與消耗的平衡[9]。有研究顯示，在體內有炎癥和組織損傷的情況下，細胞外的ATP濃度顯著升高[10,11]。急性脊髓損傷會產生一個廣泛的炎癥場所，可以影響腦缺血和脊髓損傷[12,13]。大鼠脊髓損傷時，在損傷周圍有大量的ATP釋放，持續釋放時間大于6 h[14]。本試驗結果提示脊髓缺血再灌注損傷可以導致脊髓中ATP酶活性下降，影響脊髓的功能，進而影響整個機體的供血能力。而鋅離子則可能通過提高ATP酶的活性，從而對脊髓缺血再灌注損傷起到保護作用。

本研究顯示，各組大鼠脊髓組織中MAO活性和T-AOC含量的差異具有統計學意義(P<0.05)。模型組和各硫酸鋅處理組大鼠脊髓組織內的MAO活性均顯著高于假手術組(P<0.05)，且100 mg/kg/d 硫酸鋅處理組MAO活性明顯低于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)。模型組和各硫酸鋅處理組大鼠脊髓組織內的T-AOC含量顯著低于假手術組(P<0.05)。且模型組大鼠脊髓組織中T-AOC含量最低，隨著硫酸鋅劑量的增加，T-AOC含量呈上升趨勢。提示脊髓缺血再灌注損傷導致脊髓組織MAO活性升高，這可能是由于脊髓缺血再灌注損傷對單胺類神經遞質水平產生了一定的影響。同時降低脊髓組織內T-AOC含量，對脊髓神經系統具有一定的氧化損傷作用。而鋅具有抗氧化性，通過抑制MAO活性和升高T-AOC含量，從而對脊髓缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

MAO是機體內廣泛參與芳香族、脂肪族單胺類物質代謝的一類酶,其主要功能為催化內源性和外源性單胺類神經遞質并使之迅速氧化，生成醛、氨和過氧化氫，因此可以調節機體內胺濃度。MAO主要存在于線粒體上，與膜緊密結合，和細胞的氧化密切相關。MAO可分為A、B兩型，其中A型(MAO-A)的底物是五羥色胺和去甲腎上腺素,然而B型(MAO-B)的底物為苯甲胺和苯乙基胺[15]。有研究結果表明，家兔慢性脊髓損傷早期導致脊髓組織MAO值升高[16]。T-AOC是機體對抗過氧化損傷能力的體現，正常生理情況下，機體存在著有效的抗氧化防御體系，這使得活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生與清除均處于一種動態平衡的狀態，以維持生理水平的ROS濃度[17]。當機體的總抗氧化能力降低時，則易引起炎癥、腫瘤、糖尿病、免疫系統等疾病，因此，T-AOC能夠很好地反映機體內防御系統抗氧化能力的強弱程度。

綜上所述，通過建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，觀察了硫酸鋅預處理對大鼠脊髓組織的ATP酶、MAO和T-AOC活力的影響，初步探討鋅離子在脊髓缺血再灌注損傷中的保護作用相關機制，為脊髓缺血再灌注損傷臨床治療提供了試驗依據。

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摘要：目的方法研究外源性補鋅對脊髓缺血再灌注損傷大鼠ATP酶、MAO活性和T-AOC含量的影響，從而探討鋅對脊髓缺血再灌注損傷的保護作用的機制。方法 60只Wistar大鼠隨機分為5組，每組12只，雌雄各半，分別為假手術組、模型組、硫酸鋅預處理高劑量組(100 mg/kg)、中劑量組(50 mg/kg)和低劑量組(25 mg/kg)。各劑量組每日灌胃給予硫酸鋅1次，連續7天。假手術組和模型組給予相同劑量生理鹽水，7天后制備脊髓缺血再灌注損傷動物模型，損傷后24 h采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)運動功能評分法對脊髓缺血再灌注損傷模型進行后肢神經功能評價；測定脊髓組織中ATP酶、MAO活性和T-AOC含量。結果與模型組比較，各給鋅組大鼠神經功能評分明顯高于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)。各硫酸鋅處理組Na+-K+-ATP酶活性明顯低于假手術組(P<0.05)，但明顯高于模型組(P<0.05)。模型組和各硫酸鋅處理組脊髓組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著低于假手術組(P<0.05)。模型組和各硫酸鋅處理組大鼠脊髓組織內的MAO活性均顯著高于假手術組(P<0.05)，且100 mg/kg/d 硫酸鋅處理組MAO活性顯著低于模型組(P<0.05)。模型組和各硫酸鋅處理組大鼠脊髓組織內的T-AOC含量顯著低于假手術組(P<0.05)。模型組大鼠脊髓組織中T-AOC含量最低，隨著硫酸鋅劑量的增加，T-AOC含量呈上升趨勢。結論鋅可能通過提高ATP酶的活性、抑制MAO活性和升高T-AOC含量，從而對脊髓缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

關鍵詞：鋅；脊髓缺血再灌注損傷；ATP；MAO；T-AOC

Effect of zinc on the ATP enzyme、MAO activity and T-AOC contentof rats with spinal cord ischemia-reperfusion injuryLIULei1,MENGChun-yang1,LIPeng2,etal.(1.DepartmentofOrthopaedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China;2.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of the exogenous zinc supplement on the ATP enzyme、MAO activity and T-AOC content of rats with spinal cord ischemia- reperfusion injury in order to explore the mechanism of protective effect of zinc on the spinal cord ischemia-reperfusion injury.Methods60 Wistar rats were randomly divided into five groups:sham-operation group,model group,and zinc sulfate pre-treatment groups including high-dose zinc group (100 mg/kg),middle-dose zinc group (50 mg/kg)and low-dose zinc group(25 mg/kg),12 rats in each group,half male and half female.In all the zinc pre-treatment groups,rats were administered zinc sulfate one time by gavage in seven days succession.The rats in sham-operation group and model group were administered the same volume normal saline solution as zinc pre-treatment group.Spinal cord ischemia-reperfusion injury model was established after zinc pretreatment for 7days.24 h after injury,Motor function assessment of rats were performed by Basso Beattie Bresnahan (BBB) Motor Function Assessment;ATP enzyme,MAO activity and T-AOC content in spinal cord were detected.ResultsBBB motor function assessment of zinc group were significantly higher than that of model group (P<0.05).Na+-K+-ATP enzyme activity in zinc pre-treatment groups was significantly lower than that in sham-operation group(P<0.05),but significantly higher than that in model group(P<0.05).Ca2+-Mg2+-ATP enzyme activity in rats in model group and zinc pre-treatment groups was significantly lower than that in sham-operation group(P<0.05).MAO activity in rats in model group and zinc pre-treatment groups significantly higher than that in sham-operation group(P<0.05).And MAO activity in rats in high-dose zinc group (100 mg/kg)was significantly lower than that in model group (P<0.05).T-AOC activity in rats in model group and zinc pre-treatment groups was significantly lower than that in sham-operation group (P<0.05),T-AOC content in model group was the lowest and increased with the increasing of zinc dose.Conclusionzinc has a protective effect on spinal cord ischemia-reperfusion injury by possibly.

Key words:Zn;ischemia- reperfusion injury;ATP;MAO;T-AOC

收稿日期：(2014-01-28)

作者簡介：劉磊(1979-)，男，吉林省九臺市人，主治醫師，醫學學士，研究方向：脊髓損傷。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R446.11+2

文章編號：1007-4287(2015)01-0010-04

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