粘質(zhì)沙雷菌整合子檢測及其與耐藥表型的相關(guān)性分析

蘇維奇，朱元祺,李　莉，畢春霞，閆志勇，鄧乃梅

(1.青島市市立醫(yī)院 a.檢驗科；b.醫(yī)院感染管理科，山東 青島266011；

2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物教研室)

粘質(zhì)沙雷菌整合子檢測及其與耐藥表型的相關(guān)性分析

蘇維奇1a，朱元祺2,李莉1a，畢春霞1a，閆志勇3，鄧乃梅1b*

(1.青島市市立醫(yī)院 a.檢驗科；b.醫(yī)院感染管理科，山東 青島266011；

2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物教研室)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0014)

粘質(zhì)沙雷菌是一種重要的條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院的環(huán)境中，在機(jī)體抵抗力低下時，可引起呼吸道感染、傷口感染、泌尿道感染以及敗血癥等多種疾病，并可引起醫(yī)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行[1]。近年來，粘質(zhì)沙雷菌的檢出率逐年增高，并且其耐藥現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重，該菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，包括產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶、藥物作用的靶位改變以及外膜通透性障礙等，其耐藥基因可借助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等多種耐藥基因移動遺傳因子，在菌種間傳播和傳遞。為了解本地區(qū)粘質(zhì)沙雷菌臨床分離株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的攜帶情況及其與耐藥表型的相關(guān)性，我們對臨床分離的287株粘質(zhì)沙雷菌進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子檢測，探討整合子與耐藥表型的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1菌株來源實驗菌株來源于青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市市立醫(yī)院的臨床分離株，共計287株，所有菌株均經(jīng)VITEK-2 Compact細(xì)菌分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，所用菌株鑒定板型為GNI卡，藥敏板型為GNS卡，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2細(xì)菌DNA提取采用煮沸法，取細(xì)菌培養(yǎng)液2 ml,11 500 g離心1 min，盡量吸凈上清，向沉淀物中加入200 μl緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮，向管中加入20 μl蛋白酶K溶液，混勻，加入220 μl緩沖液GB，震蕩15 sec，70℃放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，加入220 μl無水乙醇，充分震蕩混勻15 sec，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，然后移入吸附柱CB3中放到收集管里，13 400 g離心30 s,棄去廢液再加入500 μl緩沖液GD，13 400 g離心30 s,棄去廢液，加入600 μl漂洗液PW，13 400 g離心30 s,棄去廢液，加入50-200 μl洗脫緩沖液TE，室溫放置30 min，將溶液收集至離心管中備用。

1.3PCR引物的設(shè)計與合成參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子整合酶編碼基因的特異性引物，引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子基因的特異性引物，引物序列及產(chǎn)物大小

1.4PCR反應(yīng)及條件優(yōu)化按照配制的PCR反應(yīng)混合物，PCR反應(yīng)體系,RNase Free H2O 17.37 μl,10×PCR Buffer2.5 μl,上游引物(10 μM)1.0 μl,下游引物(10 μM)1.0 μl,TaKaBa Taq(5 U/μl)0.13 μl,模板DNA 1.0 μl,總體積25.0 μl。經(jīng)反復(fù)試驗優(yōu)化，確定PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃，30 s，退火46℃，30 s，延伸72℃，30 s，共30個循環(huán)，延伸72℃ 10 min。

1.5擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測取5 μl PCR產(chǎn)物，在含0.5 μg/ml溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.6藥敏試驗采用VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析儀配套的革蘭陰性桿菌藥敏卡GNS進(jìn)行藥敏試驗，抗菌藥物包括氨芐西林、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和哌拉西林，頭孢哌酮/舒巴坦采用K-B法，藥敏結(jié)果按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2011年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0軟件分析Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥差異，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1整合子檢測結(jié)果在287株粘質(zhì)沙雷菌中，有262株細(xì)菌檢出Ⅰ類整合子，檢出率為91.3%，3株細(xì)菌檢出Ⅲ類整合子，未檢出Ⅱ類整合子。部分粘質(zhì)沙雷菌Ⅰ類整合子PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

M：100 bp ladder marker(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1 000 bp)；1-13：臨床標(biāo)本；N：陰性對照；P：陽性對照

圖1粘質(zhì)沙雷菌Ⅰ類整合子(intI)PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2Ⅰ類整合子陽性與陰性菌株藥敏結(jié)果比較Ⅰ類整合子陽性菌株對環(huán)丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率高于Ⅰ類整合子陰性菌株(P均<0.05)，對其他抗菌藥物的耐藥性，Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),見表2。

表2　Ⅰ類整合子陽性菌株與陰性菌株的藥敏結(jié)果

3討論

整合子是存在于細(xì)菌質(zhì)粒和(或)染色體上的一種遺傳結(jié)構(gòu)，它具有捕獲、重排和表達(dá)耐藥基因的能力，是細(xì)菌多重耐藥迅速發(fā)展的重要原因[3]。整合子在整合酶的催化下，能通過位點專一重組系統(tǒng)整合外來的耐藥基因，使耐藥基因不斷的積累，從而使細(xì)菌具有耐藥性和多重耐藥性，并通過整合機(jī)制使得耐藥基因快速傳播和擴(kuò)散[4]。

整合子在參入細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散方面，受整合子整合酶、整合子基因盒以及Ⅰ型整合子樣結(jié)構(gòu)和插入序列共同區(qū)(ISCR1)等物質(zhì)的作用和影響。有文獻(xiàn)報道，ISCR1的廣泛存在可能會造成多種耐藥基因的流行和跨種屬傳播[5]。然而孫靜靜等在對59株泛耐藥鮑曼不動桿菌整合子Ⅰ和ISCR1結(jié)構(gòu)及基因型研究中發(fā)現(xiàn)，ISCR1的攜帶率較低，Ⅰ類整合子的檢出率高達(dá)86%，而ISCR1的檢出率只有5.3%[6]，由此可見，整合子與ISCR1之間的相互關(guān)系是否在不同細(xì)菌的種屬間存在差異還有待進(jìn)一步研究。

本項目研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在287株粘質(zhì)沙雷菌中，有262株細(xì)菌檢出Ⅰ類整合子，檢出率為91.3%，3株細(xì)菌檢出Ⅲ類整合子，未檢出Ⅱ類整合子，Ⅰ類整合子的檢出率高于陰溝腸桿菌(77.9%)和肺炎克雷伯菌(57.91%)等腸桿菌科細(xì)菌[7,8]，說明Ⅰ類整合子在粘質(zhì)沙雷菌中普遍存在。Ⅰ類整合子陽性菌株對環(huán)丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率明顯高于Ⅰ類整合子陰性菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與菌株攜帶qnr基因和blaCTX-M基因有關(guān)。Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株對青霉素類和大多數(shù)頭孢類藥物的耐藥表型差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過對287株粘質(zhì)沙雷菌整合子的攜帶情況與其耐藥表型比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷菌Ⅰ類整合子的攜帶率較高，并且在粘質(zhì)沙雷菌中整合子與其耐藥表型特別是與多重耐藥性無明顯的相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ktari S,Mahjoubi F,Mnif B,et al.Investigation of three nosocomial outbreaks of Serratia marcescens in an intensive care unit in Sfax-Tunisia[J].Tunis Med,2010,88(7):501.

[2]Goldstein C,Lee MD,Sanchez S,et al.Incidence of class 1 and 2 integrases in clinical and commensal bacteria from livestock,companion animals,and exotics[J].Antimicrob Agents Chemother,2001，45:723.

[3]Rech GD,Hall RM.Gene Cassettes A new class of mobile element[J].Microbiology,1995,141(12):3015.

[4]李彥媚，趙喜紅，徐澤智，等.新型細(xì)菌耐藥元件—整合子系[J].中國抗生素雜志，2012,31(1)：1.

[5]陳霞，袁敏，李桂喜，等.基因捕獲元件int1和ISCR1在臨床菌株中的分布及與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系研究[J].中國人畜共患病學(xué)報，2013,29(7)：646.

[6]孫靜靜，吳奎海，陳清，等.泛耐藥鮑曼不動桿菌整合子Ⅰ和ISCR1結(jié)構(gòu)及基因分型研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012,12(4)：390.

[7]李巖，蘇建榮，徐淑珍，等.陰溝腸桿菌的Ⅰ類整合子檢測及相關(guān)耐藥基因分析[J].中國實驗診斷學(xué)雜志，2010,14(9)：1356.

[8]毛璞，傅威，邱桂霞，等.肺炎克雷伯菌Ⅰ類整合子的檢測與鑒定[J].中國抗生素雜志，2013,38(3)：235.

摘要：目的了解本地區(qū)粘質(zhì)沙雷菌臨床分離株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的攜帶情況，探討整合子與其耐藥表型的相關(guān)性。方法收集臨床分離的經(jīng)VITEK-2 Compact細(xì)菌分析系統(tǒng)鑒定的粘質(zhì)沙雷菌287株，以煮沸法制備細(xì)菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測菌株的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子，分析比較整合子陽性菌株與陰性菌株的藥敏試驗結(jié)果差異。結(jié)果在287株粘質(zhì)沙雷菌中，有262株細(xì)菌檢出Ⅰ類整合子，檢出率為91.3%，3株細(xì)菌檢出Ⅲ類整合子，未檢出Ⅱ類整合子。藥敏結(jié)果顯示，第Ⅰ類整合子陽性菌株對環(huán)丙沙星和頭孢噻肟的耐藥率高于Ⅰ類整合子陰性菌株(P均<0.05)，對其他抗菌藥物的耐藥性，Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論Ⅰ類整合子在粘質(zhì)沙雷菌中普遍存在，Ⅰ類整合子與粘質(zhì)沙雷菌的多重耐藥無明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：粘質(zhì)沙雷菌；耐藥性；整合子

Serratia marcescens integron test and Associated analysis with drug resistance phenotypeSUWei-qi,ZHUYuan-qi,LILi,etal.(Departmentoflaboratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)

Abstract:ObjectiveUnderstanding of the carrying situation in the region of Serratia marcescens isolates Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ integron,To explore the relationship between integrons and drug resistance phenotype.MethodsClinical isolates collected by VITEK-2 Compact analysis system for identification of 287 strains of Serratia marcescens.Prepared to boil PCR amplification of bacterial DNA as a template,using the polymerase chain reaction (PCR) testing of classⅠ,Ⅱ,Ⅲ integron.Analysis and comparison the differences of integron positive strains and negative strains in drug sensitive test.ResultsIn 287 strains of Serratia marcescens,262 strains of bacteria detected integron,the detection rate was 91.3%,3 strains of bacteria detected class Ⅲ integron,II integron were not detected.The drug sensitivity results showed,the classⅠ integron positive strains resistant to ciprofloxacin and cefotaxime were higher than that of Ⅰintegron negative strains (P<0.05).Resistance to other antimicrobial drugs,among Ⅰ integron positive and negative strains were no significant differences (P>0.05).ConclusionⅠ integron prevalent in Serratia marcescens,class Ⅰ integron and multidrug-resistant Serratia marcescens is no significant correlation.

Key words:Serratia marcescens;Drug resistance;Integron

收稿日期：(2014-05-10)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R446.5

文章編號：1007-4287(2015)01-0014-03

通訊作者*

基金項目：青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目[2012-1-3-1-(18)-nsh]