利巴韋林對hep-2細胞的放療增敏作用觀察

利巴韋林對hep-2細胞的放療增敏作用觀察

朱飛,李鴻燕,趙明,陳鷗*

(吉林大學第二醫院,吉林 長春130041)

近年來喉癌的治療越來越注意保留喉功能，放射治療的重要性逐漸增加[1],而放療抵抗則是難以回避的問題，放療增敏成為新的任務。很多人類腫瘤組織尤其是喉癌中發現了翻譯起始因子4E(eIF4E)，它的過度表達被認為和疾病進展密切相關[2]，可以作為放療增敏的新靶點[3]。利巴韋林是一種廣泛應用的抗病毒藥物，在現今臨床實驗中被發現可以抑制eif4e[4]。本文是以人喉癌細胞系 Hep-2 為對象，研究利巴韋林對其放療敏感性的影響，以初步探究利巴韋林能否作為一種新的放療增敏藥物。

1材料與方法

1.1　細胞株

人喉癌細胞系 Hep-2，由吉林大學第二醫院耳鼻喉科實驗室提供，復蘇后傳代培養。

1.2　藥物、試劑及儀器

注射用利巴韋林，粉劑，0.25 g一支，品牌名為奇力清。

RPMI-1640 培養基、PBS緩沖液、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自hyclone公司；碘化丙錠(PI )及 AnnexinV-FITC 試劑盒購自天津三箭生物技術有限公司X線治療機由吉大二院放療科提供；流式細胞儀由吉大二院中心實驗室提供。

1.3　試驗方法

1.3.1細胞培養人喉癌細胞 Hep-2 置于含 10% 胎牛血清 RPMI-1640 培養液中貼壁培養，于 37℃ 5%CO2孵箱中孵育，常規傳代換液。

1.3.2細胞分組取對數期生長的 Hep-2細胞按 1 ×105個/ml胞接種于A、B 2個 6孔培養板，A板對照組，B板放療組，每個板4個孔，37℃ 5% CO2孵箱中孵育 24 h。換液后加入加入利巴韋林PBS溶液，使AB兩板各孔利巴韋林濃度依次為：0 mg/L，2 mg/L，4 mg/L，8 mg/L，放入孵箱孵育24H。B 板室溫下6MV-X 線單次照射，照射條件為：源皮距(SSD) 75 cm，照射野為12.5×8.5 cm，A板不予照射，換液后兩板繼續孵育24H。

1.3.3消化收集細胞前觀察顯微鏡下AB兩板細胞形態變化。

1.3.4收集細胞及流式細胞檢測凋亡。以胰蛋白酶消化收集細胞，并以冷PBS清洗2遍，800 r/min離心8 min，棄去上清。遵細胞凋亡檢測試劑盒說明，以1 ml1Xbuffer重懸細胞，300 g離心3 min，棄去上清后加入1 ml1Xbuffer重懸細胞。然后取其100 μl細胞加入標記好的EP管，加入AnnexinV-FITC 及PI 5 μl避光孵育15 min，加入PBS至500 μl后混勻細胞；400 目篩網濾過后上機分析。流式細胞儀散點圖中AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡細胞，即C4象限。以C4象限細胞比率記錄為各組細胞的凋亡率。

1.3.5重復實驗3次，結果取均值。

1.4　數據分析

實驗所得數據應用 SPSS16.0軟件進行分析，假設檢驗的顯著性水平取α=0.05。

2結果

2.1A組各孔細胞貼壁生長尚可，細胞多數呈梭形或多角形，形態及大小尚均一，生長致密，偶有懸浮顆粒。B組各孔細胞形態不均，部分細胞變大，間距稀疏，可見核碎裂象，懸浮顆粒較多(圖1)。

A組B組

圖120倍光鏡下各培養板細胞形態

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡結果見表1。

表1　各孔細胞凋亡率比較

A組間4孔比較差異不明顯(P>0.05)。AB組各孔比較差異顯著(P<0.05)。B組組間其他各孔凋亡率同(7.45.0±0.45)%比較，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨著利巴韋林濃度升高，hep-2細胞凋亡增加。見圖2。

A組流式細胞圖

B組流式細胞圖

3討論

喉癌是喉部常見的惡性腫瘤，主要為鱗癌，好發于聲門或聲門上區，在耳鼻咽喉惡性腫瘤中占11%-22%[5]。近年來，喉癌的治療對保留喉功能愈發重視，放射治療的地位愈加重要。但喉癌對放療敏感性低，常出現對放療不敏感導致放療抵抗，或者大劑量放射治療后引發喉軟骨炎、喉水腫、喉軟骨壞死等不良反應[6]，因此需要新的策略提高喉癌的放療敏感性。尋找高效安全的放療增敏劑是放療增敏研究的新熱點。理想的放射增敏劑應能顯著增加腫瘤細胞的放療療效，而對正常組織沒有或很小有毒副反應[7]。

研究表明，真核細胞翻譯起始因子eiF4e可以作為放療增敏的一個靶點[8]。eIF4e在喉癌組織中高表達，顯著地改變了細胞表型，可促進細胞增殖和誘導細胞轉化、腫瘤形成和轉移，影響VEGF及bFGF表達，影響腫瘤血管生成[9]。利巴韋林是目前臨床實驗中eiF4e的直接抑制劑，在急性髓系白血病的相關研究中發現能抑制M4和M5型AML致癌基因的表達[10]。利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷，是廣譜強效的抗病毒藥物，目前廣泛應用于病毒性疾病的防治，是一種安全的臨床藥物。是以本實驗以人喉癌細胞系 Hep-2 為對象，研究利巴韋林對其放療敏感性的影響，以初步探究利巴韋林能否作為一種新的放療增敏藥物。本實驗中A組各孔未經放射治療，雖有不同濃度的利巴韋林作用，但檢測凋亡并無明顯差異，說明利巴韋林單純作用并不能明顯誘導細胞凋亡。B組中利巴韋林0mg/L的孔，可作為單純放療看待。B組中其他各孔與其相比，凋亡率隨著利巴韋林濃度的提高而上升。說明利巴韋林確實能夠起到對hep-2細胞的放療增敏作用，并且隨著劑量的提高作用更明顯。表明利巴韋林有可能在不增加放射劑量的前提下，增加放療效果，減少放射帶來的各種不良反應，從而有可能進一步提高喉癌的治愈率，降低轉移率，降低放療的不良反應。

腫瘤放療的靶向增敏還可以有包括基因治療聯合放射治療、生物制劑聯合放射治療以及基于乏氧理論的多維適形放射治療等[11]，已有信號傳導及轉錄活化因子3反義寡核苷酸基因治療聯合放療的研究[12]。利巴韋林與其相比，優點在于安全和簡便。但其作用的分子機制尚待研究，另外對于其用于放療增敏的最大安全劑量、聯合放療的最佳配比劑量等，尚需通過動物實驗進一步明確。

參考文獻：

[1]潘新良.強化喉癌的規范化治療不斷提高喉癌治療水平[J].中華耳鼻喉頭頸外科雜志，2014，49(6)： 617.

[2]Sunavala Dossabhoy G.Analysis of eIF4E and 4EBP1 mRNAs in head and neck cancer[J].Laryngoscope,2011,121(10):2136.

[3]Hayman TJ, Williams ES.Translation initiation factor eIF4E is a target for tumor cell radiosensitization[J].Cancer Res,2012,72(9):2362.

[4]蔣鑫.利巴韋林與eiF4E相關性急性髓系白血病的研究進展[J].國際輸血及血液學雜志,2013,36(3):244.

[5]杜靈彬,毛偉敏.中國2003-2007年喉癌發病率和死亡率分析[J].中華流行病學雜志，2013(16):395.

[6]徐志淵.放療后生存5年以上局部晚期喉癌的預后因素分析[J].國際腫瘤學雜志，2011,38(11):861.

[7]駱云珍等.喉癌放射抵抗及靶向放射增敏研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014,49(6):520.

[8]YangH,In vivo study of breast carcinoma radiosensitization by targeting eIF4E[J].Biochem Biophys Res Commun，2012,423(4):878.

[9]馬敏杰等.真核細胞翻譯起始因子4E、血管內皮生長因子與食管癌血管生成及轉移的關系[J].重慶醫科大學學報，2010,35(11):1634.

[10]Borden KL, Culjkovic-Kraljacic B.Ribavirin as an anti-cancer therapy: acute myeloid leukemia and beyond[J].Leuk Lymphoma,2010,51(10):1805.

[11]董濟民，腫瘤放療增敏研究進展[J].陜西醫學雜志2011,40(4):493.

[12]李曉明.Stat3反義寡核苷酸對喉癌Hep-2細胞放療增敏作用的分子機制[J].中國癌癥防治雜志，2010，02(4):261.

收稿日期：(2014-01-26)

文章編號：1007-4287(2015)01-0025-03

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