實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值

楊　柳，蘇明權(quán)，馬越云，辛毅娟，韓若冰，張　榮，文　靜，郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍醫(yī)學(xué)檢驗中心，陜西 西安710032)

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值

楊柳，蘇明權(quán)，馬越云，辛毅娟，韓若冰，張榮，文靜，郝曉柯*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍醫(yī)學(xué)檢驗中心，陜西 西安710032)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0035)

結(jié)核性腦膜炎是結(jié)核病中最常見的病種，主要是由于結(jié)核分枝桿菌侵入到蛛網(wǎng)膜下隙，繼而引起軟腦膜、蛛網(wǎng)膜并累及腦神經(jīng)和腦實質(zhì)等的非化膿性炎癥[1]。目前對結(jié)核性腦膜炎的診斷主要根據(jù)病史、癥狀及體征、腦脊液的實驗室檢查等綜合評估而作出診斷。但研究顯示,結(jié)核性腦膜炎的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查并不典型，因而對結(jié)核性腦膜炎的診斷常出現(xiàn)漏診和誤診，進(jìn)而延誤對患者病情的救治[2]。因此，快速、有效地檢測結(jié)核分枝桿菌并作出臨床診斷是有效改善患者病情的重要手段[3]。本研究采用涂片、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)對神經(jīng)系統(tǒng)類疾病的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核性分枝桿菌檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，以期為指導(dǎo)臨床診斷結(jié)核性腦膜炎提供參考。

1資料與方法

1.1　一般資料

選取2010年5月—2013年5月我院神經(jīng)內(nèi)科門診和感染科門診收治的57例結(jié)核性腦膜炎患者、105例疑似結(jié)核性腦膜炎患者和120例非結(jié)核性腦膜炎患者為研究對象。其中結(jié)核性腦膜炎67例，男37例，女30例，年齡18-71歲，平均(35.7±12.6)歲；疑似結(jié)核性腦膜炎105例，男63例，女42例，年齡21-70歲，平均(36.2±13.1)歲，其中癲癇11例，腦炎35例，腦積水13例，腦梗死15例，嗜睡6例，顱內(nèi)感染10例，脊髓病變8例，其他如抽搐、四肢無力等5例；非結(jié)核性腦膜炎120例，男69例，女51例，年齡19-72歲，平均(36.8±11.5)歲，其中病毒性腦膜炎56例，新型隱球菌腦膜炎19例，化膿性腦膜炎45例。

結(jié)核性腦膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：①在急性或者亞急性腦膜炎基礎(chǔ)上，經(jīng)腦脊液檢查有結(jié)核菌存在，或者皮膚結(jié)核菌素試驗顯示為陽性；②患者血、腦脊液經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查均為陰性；③存活病例經(jīng)抗結(jié)核治療后好轉(zhuǎn)或痊愈。

1.2　方法

1.2.1涂片法對入院后的患者行腰椎穿刺，并抽取部分腦脊液標(biāo)本留待后用。取腦脊液標(biāo)本1 ml，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，保留離心后的沉渣進(jìn)行涂片和固定，并進(jìn)行抗酸染色，最后在顯微鏡視野下觀察結(jié)核桿菌。整個過程嚴(yán)格按照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》進(jìn)行。抗酸染色劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2RT-PCR法將抽取的非血性腦脊液標(biāo)本中的1 ml置于1.5 ml的無菌離心管中，在1 4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，然后將1 ml無菌生理鹽水加入到離心棄去上清液的沉淀中，同時振蕩使之均勻懸浮，將沉淀留待后用。將抽取的血性腦脊液1 ml置于1.5 ml的無菌離心管中，在14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，然后將1 ml無菌去離子水加入到棄去上清液的沉淀中，并反復(fù)洗滌溶液使紅細(xì)胞被洗掉，最后留下沉淀以備后用。分別在兩種沉淀中加入50 μl DNA提取液，并將其振蕩以混合均勻，然后將其置于100℃的金屬浴中，10 min后，在14 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取離心后的上清液2 μl并將其置于到聚合酶鏈反應(yīng)的試管內(nèi)。最后進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)，步驟為：在92℃條件下進(jìn)行預(yù)變性，2 min后按照93℃的環(huán)境45 s，然后在55℃的環(huán)境50 s進(jìn)行10個循環(huán)，循環(huán)完成后，再按照93℃的環(huán)境30 s，55℃的環(huán)境45 s進(jìn)行30個循環(huán)。結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)<30且曲線是標(biāo)準(zhǔn)的S形，結(jié)果計為陽性；如果Ct沒有出現(xiàn)數(shù)值，則結(jié)果計為陰性。其中RT-PCR的檢測試劑為結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供)，檢測儀器為美國ABI-7500實時熒光定量PCR儀。

1.3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析，計數(shù)資料描述采用率(%)，比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　三組患者腦脊液涂片和RT-PCR法檢測結(jié)果比較

涂片法檢測發(fā)現(xiàn)10例陽性，其中結(jié)核性腦膜炎7例(70.00%)，疑似結(jié)核性腦膜炎3例(30.00%)；RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)46例陽性，其中結(jié)核性腦膜炎31例(67.39%)，疑似結(jié)核性腦膜炎15例(32.61%)。在結(jié)核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為12.28%，RT-PCR法陽性率為54.39%，涂片法陽性率低于RT-PCR法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在疑似結(jié)核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為2.91%，RT-PCR法陽性率為14.56%，涂片法檢測的陽性率低于RT-PCR法的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　三組患者腦脊液涂片法和RT-PCR法檢測結(jié)果比較　例

2.2　兩種檢測方法的診斷價值

腦脊液涂片法檢測結(jié)核性腦膜炎的靈敏度為12.28%，漏診率為87.72%，特異度為100%；RT-PCR法檢測的靈敏度為54.39%，漏診率為45.61%，特異度為100%，RT-PCR法的靈敏度高于涂片法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　兩種方法在結(jié)核性腦膜炎患者中的診斷價值

注：※與涂片法比較，P<0.05。

3討論

結(jié)核性腦膜炎是臨床常見的嚴(yán)重的肺外結(jié)核病，具有病死率高和致殘率高等特點，嚴(yán)重地威脅著患者的健康和生命質(zhì)量。結(jié)核性腦膜炎由于不典型的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，常常延誤對病情的診治而導(dǎo)致患者的預(yù)后較差，因而，早期準(zhǔn)確的診斷和及時有效的治療是改善患者病情和提高臨床預(yù)后最有效的手段[5]。目前，臨床上對結(jié)核性腦膜炎最有效的診斷方法是在腦脊液中檢出結(jié)核分枝桿菌，傳統(tǒng)的診斷結(jié)核性腦膜炎的方法是涂片法，即對結(jié)核桿菌進(jìn)行培養(yǎng)并對標(biāo)本涂片檢測。涂片法因為具有簡便、快速等特點而廣受臨床醫(yī)生的關(guān)注，但有報道顯示涂片法的靈敏度低，特異度差，同時也不能將死菌和活菌區(qū)分開來[6]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，RT-PCR法因為方法學(xué)方面的優(yōu)越性而逐漸用于基因表達(dá)、病原體檢測等研究領(lǐng)域[7]。該方法具有以下優(yōu)點：①在常規(guī)的PCR法基礎(chǔ)上，RT-PCR法加入了熒光探針，從而將核酸擴(kuò)增、雜交以及光譜技術(shù)巧妙地融合在一起；②RT-PCR法不需要將管蓋打開，因而對實驗室造成PCR產(chǎn)物的污染；③RT-PCR法的整個過程和結(jié)果均由計算機(jī)操作，因此簡單快速；④靈敏度高、重現(xiàn)性好，同時還能根據(jù)每個樣本Ct值而獲得標(biāo)準(zhǔn)的S形曲線；⑤通過實時監(jiān)測RT-PCR法的整個過程，解決了傳統(tǒng)方法中只能對終點進(jìn)行定量檢測的缺陷。

查閱國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于涂片法和RT-PCR法檢測結(jié)核性腦膜炎的診斷價值比較的文獻(xiàn)還很少。本研究采用兩種方法分別對結(jié)核性腦膜炎、疑似結(jié)核性腦膜炎和非結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為12.28%，RT-PCR法的陽性率為67.39%，與唐神結(jié)等人[8]的研究結(jié)果相似，并且涂片法陽性率低于RT-PCR法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而在疑似結(jié)核性腦膜炎患者的檢測中，涂片法陽性率為2.91%，RT-PCR法陽性率為14.56%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示我們RT-PCR法作為檢測結(jié)核性腦膜炎的方法診斷價值較高。結(jié)果還顯示，腦脊液涂片法檢測結(jié)核性腦膜炎的靈敏度為12.28%，漏診率為87.72%，說明傳統(tǒng)方法檢測結(jié)核性腦膜炎的靈敏度較低，與有關(guān)研究結(jié)果一致[9]。RT-PCR法檢測的靈敏度為54.39%，高于涂片法的靈敏度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與有關(guān)研究結(jié)果一致[10]，提示我們RT-PCR法檢測結(jié)核性腦膜炎的靈敏度高。因此，如果患者出現(xiàn)結(jié)核性腦膜炎的明顯臨床癥狀和體征時，建議早期且持續(xù)地進(jìn)行腦脊液結(jié)核分枝桿菌檢測具有重要的臨床價值。但是本研究中RT-PCR法的陽性率低于其他研究報道[11]，可能原因是：①患者進(jìn)行了抗結(jié)核治療，導(dǎo)致在檢測過程中出現(xiàn)了低陽性率；②由于對腦脊液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌DNA的拷貝數(shù)量較低，繼而沒有達(dá)到試劑檢測的下限，因此，檢測結(jié)果可能顯示為陰性；③在腦脊液標(biāo)本采集過程中，有部分沉渣可能存在剝脫現(xiàn)象，因而可能引起結(jié)果檢出率的下降。

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摘要：目的探討實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值。方法分別采用涂片法、RT-PCR法對結(jié)核性腦膜炎、疑似結(jié)核性腦膜炎以及非結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果涂片法共檢出10例陽性，其中結(jié)核性腦膜炎7例(70.00%)，疑似結(jié)核性腦膜炎3例(30.00%)；RT-PCR法共檢出46例陽性，其中結(jié)核性腦膜炎31例(67.39%)，疑似結(jié)核性腦膜炎15例(32.61%)。對結(jié)核性腦膜炎患者檢測，涂片法陽性率(12.28%)低于RT-PCR法陽性率(54.39%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對疑似結(jié)核性腦膜炎患者檢測，涂片法陽性率(2.91%)低于RT-PCR法陽性率(14.56%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腦脊液涂片法檢測結(jié)核性腦膜炎的靈敏度為12.28%，漏診率為87.72%，RT-PCR法檢測的靈敏度為54.39%，漏診率為45.61%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RT-PCR法診斷結(jié)核性腦膜炎具有靈敏度好，準(zhǔn)確度高等特點，臨床有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：結(jié)核性腦膜炎；腦脊液；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)；診斷價值

The diagnosis value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction in tuberculous meningitisYANGLiu，SUMing-quan，MAYue-yun，etal.(InspectionArmyMedicalCenter,XijingHospitalofTheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian,Shanxi,710032)

Abstract:ObjectiveTo investigate the diagnosis value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(TR-PCR) in tuberculous meningitis.MethodsThe cerebrospinal fluid specimens of patients with tuberculous meningitis,suspected tuberculous meningitis and non-tuberculous meningitis were detected by using smear method and RT-PCR respectively,and the testing?results were compared and analyzed.ResultsThere were 10 cases of positive by smear method,including 7 cases of tuberculous meningitis(70.00%) and 3 cases of suspected tuberculous meningitis(30.00%);while 46 cases of positive by TR-PCR method,including 31 cases of tuberculous meningitis(67.39%) and 15 cases of suspected tuberculous meningitis(32.61%).In detection of patients with tuberculous meningitis,the positive rate by smear method was 12.28%,which was lower than 54.39% by RT-PCR method,the difference was statistically significance(P<0.05).In detection of patients with suspected tuberculous meningitis,the positive rate in smear method was 2.91%,which was lower than 14.56% in RT-PCR method,the difference was statistically significance(P<0.05).The sensitivity of smear method in detecting tuberculous meningitis was 12.28%,and the rate of missed diagnosis was 87.72%,while the RT-PCR was 54.39% and 45.61% respectively,the sensitivity of TR-PCR was higher than that of smear method,the difference was statistically significance(P<0.05).ConclusionRT-PCR in diagnosis of tuberculous meningitis has a characteristic of good sensitivity,high accuracy,and it has an important clinical significance.

Key words:Tuberculous meningitis;cerebrospinal fluid;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction;Diagnosis value

收稿日期：(2013-12-24)

作者簡介：楊柳(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師、講師，從事分子生物學(xué)診斷方面的研究；郝曉柯(1959-)，男，博士，主任醫(yī)師、教授，從事檢驗診斷學(xué)方面的研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R529.3

文章編號：1007-4287(2015)01-0035-04

通訊作者*