miRNA-10a表達與炎癥性腸病患者炎性反應的關系及診斷意義研究

miRNA-10a表達與炎癥性腸病患者炎性反應的關系及診斷意義研究

王麗強1,林思彤2,邵琦3,玄延花4*

(1.延邊大學病理與病理生理學2012級研究生,吉林 延吉133000;2.吉林大學中日聯誼醫院 內分泌科，吉林 長春130033;

3.浙江省寧波市中醫院 超聲科，浙江 寧波315000;4.延邊大學 病理與病理生理學教研室，吉林 延吉133000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，是一組腸道慢性非特異性炎性反應性疾病，發病原因不明，可能是易感人群在腸黏膜環境改變、屏障缺陷及持續感染等多種因素作用下導致的異常腸道免疫反應[1]。miRNA是一類長約20-25個核苷酸、具有調控功能的內源性非編碼RNA，有研究指出[2]，自身免疫性疾病中均發現miRNA出現異常表達。動物實驗顯示[3]，腸炎小鼠腸上皮細胞中出現miRNA-10a異常表達，且對IL-12/23的表達進行靶向抑制。目前，關于miRNA-10a在炎癥性腸病發病過程中的作用研究較少，本研究對miRNA-10a表達與炎癥性腸病患者炎性反應的關系進行分析，探討其在炎癥性腸病患者發病及臨床診斷中的意義。

1資料與方法

1.1一般資料收集2012年3月至2013年4月在我院消化內科行結腸鏡檢查的活動性炎癥性腸病患者40例，所有患者均符合2007年中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組診斷共識[4]，其中，潰瘍性結腸炎18例，男性12例，女性6例，平均年齡38.7±9.2歲；克羅恩病22例，男性12例，女性10例，平均年齡34.1±7.6歲。選取同期行結腸鏡檢無異常的健康者15例，其中，男性9例，女性6例，平均年齡41.6±9.4歲。排除檢查前1個月使用過免疫抑制劑及生物制劑、糖皮質激素、過水楊酸制劑者，合并有其他自身免疫性疾病者、感染性疾病者，以及患有腫瘤者。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者均進行知情同意。

1.2　方法

1.2.1標本收集 對所有行結腸鏡檢患者和健康者采集結腸粘膜標本，抽取5 ml靜脈血，離心后取血清備檢，同時，收集外周血單個核細胞標本。

1.2.2主要試劑和引物miRcute miRNA提取分離試劑盒，cDNA第1鏈合成試劑盒及熒光定量檢測試劑盒、miRNA-10a和內對照引物均購自北京天根生化科技，Perfect Real time染料法實時熒光定量試劑盒和反轉錄試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；人淋巴細胞分離液購自加拿大Cedarlane公司，根據GenBank確定IL-12/IL-23 p40引物序列，并由北京奧科鼎盛生物科技公司合成，上游：3’-GTCTCGGATTCTGGAGTGACGA-5’，下游：3’-ATTTCCTGGTCTTTCTTGGGTT-5’，擴增長度179 bp。

1.2.3熒光定量PCR將腸黏膜內鏡標本放置在液氮研缽中進行充分研磨用于提取RNA，血清和外周血單個核細胞具體提取RNA步驟參照試劑盒說明書進行，并對提取的純度、濃度和完整性進行檢測。(1)miRNA-10a含量的測定：將腸黏膜標本、血清和外周血單個核細胞提取的RNA進行反轉錄，miRNA反轉錄過程遵照cDNA第1鏈合成試劑盒操作步驟進行，由兩步完成，37℃進行60 min，熒光定量過程參照熒光定量檢測試劑盒說明進行，將cDNA 1 μl置于10 μl反應體系中進行擴增反應，94℃進行2 min，94℃進行20 s，60℃進行34 s，共進行循環42次。(2)IL-12/IL-23 p40的測定：將腸黏膜標本提取的RNA一部分用于miRNA-10a含量測定外，另一部分用于IL-12/IL-23 p40表達的測定，mRNA反轉錄過程按照反轉錄試劑盒說明進行，37℃進行15 min，85℃進行5 s，熒光定量過程參照熒光定量檢測試劑盒說明進行，將cDNA 2 μl置于20 μl反應體系中進行擴增反應，95℃進行30 s，95℃進行5 s，60℃進行30 s，共進行循環40次，利用2-△△Ct法進行相關數據處理，具體操作參照文獻[5]。

1.3　統計學處理

2結果

2.1　不同組患者結腸黏膜、血清和外周血單個核細胞中miRNA-10a表達情況

三組患者結腸黏膜、血清和外周血單個核細胞中miRNA-10a表達均不相同，差異具有統計學意義(P<0.05)，潰瘍性結腸炎組和克羅恩病組患者不同組織中miRNA-10a相對表達量均低于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，而潰瘍性結腸炎組和克羅恩病組患者之間差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

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注：與對照組相比，#P<0.05

2.2　不同組患者結腸黏膜中IL-12/IL-23 p40表達情況

不同組患者結腸黏膜中IL-12/IL-23 p40表達差異具有統計學意義(P<0.05)，潰瘍性結腸炎組和克羅恩病組患者結腸黏膜中相對表達量均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，潰瘍性結腸炎組和克羅恩病組患者之間差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2　不同組患者結腸黏膜中IL-12/IL-23 p40表達

注：與對照組相比，#P<0.05

2.3　結腸黏膜中miRNA-10a和IL-12/IL-23 p40表達相關性分析

結腸黏膜中miRNA-10a和IL-12/IL-23 p40表達呈負相關(r=-0.963，P<0.001)。

3討論

炎癥性腸病是一種病因復雜的腸道炎性疾病，發病機制尚不十分清楚，一般認為是易感基因、環境因素及免疫異常相互作用的結果，這種相互作用可以通過基因的異常表達來進行反應，一般認為miRNA可以調控部分基因的表達，越來越多的疾病發病機制研究將miRNA對蛋白表達的調控作用作為研究突破口[6]，已有研究將miRNA作為炎癥性腸病患者活動指標進行探討，對患者腸黏膜中miRNA表達情況進行分析，探討在炎癥性腸病發病中的作用。

本研究利用熒光定量PCR技術對炎癥性腸病患者miRNA-10a在腸黏膜、血清和外周血單個核細胞中表達情況，本研究顯示，miRNA-10a在三種組織中表達均不相同(P<0.05)，潰瘍性結腸炎組和克羅恩病組患者不同組織中miRNA-10a相對表達量均低于對照組(P<0.05)，說明在不同組織中miRNA-10a表達不同，患者不同組織中miRNA-10a表達均低于正常人，而不同炎癥疾病類型對miRNA-10a表達沒有影響，同時，炎癥性腸病患者外周血單核細胞中也出現了miRNA-10a表達降低，提示炎癥性腸病患者全身免疫系統可能出現了miRNA-10a表達缺失，在一定程度上加重并放大了異常炎性反應調節，從而加劇了患者疾病進展[7]。IL-12/IL-23 p40是miRNA-10a的靶基因，對于固有免疫和獲得性免疫具有重要的調控作用，與炎癥性腸病發病密切，可對患者淋巴細胞進行誘導產生大量的炎性介質，從而參與患者腸黏膜的炎癥損傷過程[8]，本研究顯示，不同組患者結腸黏膜中IL-12/IL-23 p40表達差異具有統計學意義(P<0.05)，潰瘍性結腸炎組和克羅恩病組患者結腸黏膜中相對表達量均高于對照組(P<0.05)，結腸黏膜中miRNA-10a和IL-12/IL-23 p40表達呈負相關(r=-0.963，P<0.001)，進一步說明IL-12/IL-23 p40表達與miRNA-10a密切相關，炎癥性腸病患者miRNA-10a表達下調而導致IL-12/IL-23 p40表達上調，進一步使IL-12、IL-23、p70和NOD2等效應因子大量表達，強化了細胞免疫應答，從而加劇了患者腸黏膜炎性反應損傷[9]。

綜上所述，炎癥性腸病患者結腸粘膜、血清和外周血單個核細胞中miRNA-10a均出現了表達下降，而患者結腸黏膜中IL-12/IL-23 p40出現表達升高，且不受炎癥性腸病種類影響，miRNA-10a與IL-12/IL-23 p40表達呈負相關，miRNA-10a表達下調與炎癥性腸病疾病過程緊密相關， miRNA-10a可能是炎癥性腸病治療新靶點，對患者補充miRNA-10a可能對控制病情進展起到積極作用。

參考文獻：

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收稿日期：(2013-12-21)

文章編號：1007-4287(2015)01-0064-03

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