人巨細(xì)胞病毒感染DNA檢測(cè)和IgM檢測(cè)的比較及其聯(lián)合應(yīng)用價(jià)值的探討

李玲霞，高　申，張　特，吳　苑

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長沙410013；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

人巨細(xì)胞病毒感染DNA檢測(cè)和IgM檢測(cè)的比較及其聯(lián)合應(yīng)用價(jià)值的探討

李玲霞1,2，高申2，張?zhí)?，吳苑1*

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長沙410013；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0078)

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)也稱人皰疹病毒5型，屬皰疹病毒β亞科，為線狀雙鏈DNA病毒[1]。HCMV在人群中感染率較高，常累及淋巴細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肝膽上皮細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在產(chǎn)前診斷、新生兒體查、免疫力低下、常使用免疫抑制劑的患者和移植病人中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HCMV-DNA有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以RT-PCR法檢測(cè)患者體液標(biāo)本中HCMV載量，以ELISA法檢測(cè)血清HCMV-IgM，明確這兩種方法的陽性率，比較兩種方法單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用在對(duì)于診斷患者HCMV感染中價(jià)值[2-4]。此次實(shí)驗(yàn)通過比較兩種不同的方法對(duì)HCMV感染檢測(cè)的陽性率，從而為臨床提供一種檢測(cè)HCMV的最佳方案。實(shí)驗(yàn)的結(jié)論對(duì)基層醫(yī)院開展HCMV檢測(cè)項(xiàng)目的選擇也具有一定的指導(dǎo)意義。

1儀器與方法

1.1　標(biāo)本來源

標(biāo)本來自2011年-2013年中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院各科室(n=441,男性=260，女性=181)，主要包括:新生兒病室、體檢中心、產(chǎn)科病室、移植科病室、兒科病室、急診科、血液內(nèi)科病室、婦科病室等。

1.2　主要試劑

北京貝爾生物工程有限公司生產(chǎn)的HCMV-IgM抗體檢測(cè)試劑盒；中山大學(xué)安達(dá)基因股份有限公司生產(chǎn)的HCMV核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法)，內(nèi)含有DNA提取液、HCMV-PCR反應(yīng)管(HCMV特異引物探針、酶系和Tris鹽酸緩沖液)、陽性定量參考品、弱陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、稀釋液。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HCMV-IgM抗體檢測(cè)加樣品于反應(yīng)板中，同時(shí)預(yù)留陰性對(duì)照3孔、陽性及空白對(duì)照共5孔，然后經(jīng)過搖勻、溫育、洗板、加辣根過氧化物酶標(biāo)記物、溫育、洗板、顯色、終止步驟后，使用雙波長450/630 nm進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定各孔A值，計(jì)算臨界值(Cut off=0.10+陰性對(duì)照平均A值，當(dāng)陰性對(duì)照平均A值小于0.05時(shí)，按0.05計(jì)算；當(dāng)陰性對(duì)照平均A值大于或等于0.05時(shí)按實(shí)際值計(jì)算)。A值大于等于臨界值的為陽性結(jié)果，小于臨界值的為陰性結(jié)果。

1.3.2DNA提取用煮沸裂解法按照HCMV核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR熒光法)的說明書操作處理陰性質(zhì)控品、標(biāo)本(尿、全血)、HCMV弱陽性質(zhì)控品、HCMV強(qiáng)陽性質(zhì)控品以及HCMV陽性定量參考品。

1.3.3PCR擴(kuò)增取HCMV-PCR反應(yīng)管若干，分別加入處理后上清液(含病毒DNA)以及陽性定量參考品各5 μl，離心后，放入儀器樣品槽。設(shè)置循環(huán)條件為93℃ 2 min預(yù)變性，93℃ 45 s→55℃ 60 s→先做10個(gè)循環(huán)，最后按93℃ 30 s→55℃ 45 s→做30個(gè)循環(huán)，于55℃45 s末收集熒光信號(hào)。根據(jù)陽性定量參考品的CT值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品的CT值計(jì)算DNA病毒載量，DNA拷貝數(shù)大于500 copies/ml結(jié)果為陽性，小于500 copies/ml為陰性。

2結(jié)果

2.1　HCMV-IgM檢測(cè)結(jié)果

采用ELISA定性檢測(cè)人血清或血漿樣品中HCMV-IgM，共檢測(cè)441例標(biāo)本。其中陽性77例，占17.46%，陰性364例，占82.54%。

2.2　HCMV-DNA檢測(cè)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)441例病人的HCMV-DNA檢測(cè)結(jié)果，陽性例數(shù)115例，占26.08%，陰性326例，占73.92%。

2.3　HCMV-IgM 和HCMV-DNA相關(guān)性分析

HCMV -IgM檢測(cè)結(jié)果和HCMV -DNA檢測(cè)結(jié)果比較，結(jié)果見表1，兩種方法均檢出陽性者69例；HCMV-IgM陰性而HCMV-DNA陽性的46例，HCMV-IgM陽性而HCMV-DNA陰性的8例；兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性的318例；χ2=26.74，P<0.005。按α=0.05水準(zhǔn)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可以認(rèn)為兩種方法的檢出率不同，檢測(cè)HCMV-DNA的RT-PCR方法檢出率較高。聯(lián)合檢測(cè)HCMV-IgM和 HCMV-DNA，可提高HCMV陽性檢出率，達(dá)27.89%(123/441)。

表1　HCMV-IgM和 HCMV-DNA相關(guān)性分析(n=441)

3討論

HCMV感染在免疫功能正常的人群多呈隱性感染或潛伏感染，但當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，潛伏狀態(tài)的HCMV可活化而引起發(fā)病，常見于器官移植后接受免疫抑制劑治療及惡性腫瘤患者接受化療導(dǎo)致免疫缺陷或免疫抑制狀態(tài)，如器官移植、腫瘤患者、艾滋病患者更容易遭受HCMV侵犯。另外，由于機(jī)體免疫力低下，HCMV感染可加重一些常見病患者原有疾病的癥狀甚至引起死亡。因此，對(duì)HCMV的檢測(cè)具有重要的價(jià)值，臨床上目前無檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，使用最多的是ELISA法以及RT-PCR法[5]。HCMV感染后可刺激人體產(chǎn)生特異性抗體，IgG抗體檢測(cè)不能提示急性感染，病毒包涵體雖提示病毒復(fù)制活躍，但檢測(cè)的陽性率太低[6-8]。通過檢測(cè)血清中HCMV-IgM可間接證實(shí)體內(nèi)HCMV的存在。另外，HCMV-IgM在體內(nèi)存留12～16周左右，因此在感染的早期或超過抗體存留時(shí)間采集的標(biāo)本，HCMV-IgM抗體濃度均未達(dá)到可檢測(cè)的水平，并且HCMV感染的多為免疫功能低下患者以及新生兒，也影響到抗體生成的敏感性，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果[9-11]。RT-PCR法檢測(cè)DNA屬于微量檢測(cè)，本試驗(yàn)的檢測(cè)限為500 copies/ml。HCMV感染患者尿液標(biāo)本HCMV-DNA結(jié)果陰性可能是由于腎小管上皮細(xì)胞雖已經(jīng)受HCMV侵犯，但腎小管為間歇排出HCMV病毒顆粒[2,12]，檢測(cè)結(jié)果陰性并不能排除HCMV感染，此類患者需在不同的時(shí)間段取不同來源的樣本以確證是否有HCMV-DNA的存在。

RT-PCR在全國各級(jí)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室都能普及，檢測(cè)基本自動(dòng)化，降低了人為因素對(duì)檢測(cè)的干擾，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、檢測(cè)重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高等諸多特點(diǎn)，因此對(duì)判斷病毒的活動(dòng)性和評(píng)價(jià)抗病毒治療療效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有著重要的意義[13,14]，也彌補(bǔ)了病毒分離培養(yǎng)和抗原、抗體檢測(cè)的部分不足[4]。

HCMV-IgM檢測(cè)和HCMV-DNA的聯(lián)合應(yīng)用價(jià)值:本次研究HCMV-IgM檢測(cè)陽性率為17.46%，HCMV-DNA檢測(cè)陽性率為26.08%，兩種檢測(cè)結(jié)合起來的陽性率為27.89%(123/441)高于兩者的單獨(dú)檢測(cè)。這提示兩種檢測(cè)方法對(duì)患者HCMV感染的聯(lián)合檢測(cè)提高了檢測(cè)的陽性率，降低了漏診率，從而減少了因漏診造成治療延誤帶來的不良后果，具有一定的臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)仍然存在以下不足，樣本量不夠大，對(duì)陽性DNA結(jié)果沒有進(jìn)行連續(xù)性檢測(cè)，進(jìn)一步分析DNA載量與病程的關(guān)系。

RT-PCR檢測(cè)HCMV-DNA具有良好的應(yīng)用前景，同時(shí)，對(duì)標(biāo)本采集時(shí)間和采集類型的優(yōu)化和規(guī)范化，將成為提高HCMV檢測(cè)的特異性和靈敏度、臨床醫(yī)生及時(shí)準(zhǔn)確診斷HCMV感染的一個(gè)重要方面，也是今后研究HCMV感染檢測(cè)分析前質(zhì)量控制的一個(gè)不可或缺的關(guān)鍵因素。

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摘要：目的通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法和ELISA法檢測(cè)患者體液中HCMV-DNA及HCMV-IgM，比較這兩種方法檢測(cè)的陽性率和推測(cè)其診斷人巨細(xì)胞病毒感染的價(jià)值。方法441名患者的標(biāo)本用RT-PCR法檢測(cè)HCMV-DNA，用ELISA檢測(cè)HCMV-IgM，計(jì)算兩種方法的陽性率。結(jié)果兩種方法單獨(dú)檢測(cè)的陽性率分別為26.08%和17.46%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.74，P<0.005)，RT-PCR法的陽性率高于ELISA法。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的陽性率為27.89%(123/441)，高于兩方法單獨(dú)檢測(cè)陽性率。結(jié)論用RT-PCR法檢測(cè)尿液或血液標(biāo)本HCMV-DNA與ELISA法檢測(cè)血清HCMV-IgM聯(lián)合應(yīng)用提高了患者HCMV感染檢測(cè)的陽性率，減少了漏診率。

關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法；ELISA法

Comparison of the detection of HCMV-DNA viral load and HCMV -IgM in serum with the human cytomegalovirus infection and its joint application valueLILing-xia,GAOShen,ZHANGTe,etal.(TheThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

Abstract:ObjectiveTo detect HCMV viral load in body fluids and HCMV -IgM in the serum and to study the clinical value of the combined detection for the patients with human cytomegalovirus infection.MethodsIn 441 patients，HCMV-IgM in the serum was detected by ELISA and HCMV-DNA viral load in body fluids was detected by RT-PCR,compare with these two kinds of methods to detect the positive rate and the diagnostic value.ResultsThe positive rate of two methods were 26.08% and 17.46% respectively，the significance and the difference between two methods was obviously(χ2=26.74，P<0.005).The positive rate of combined detection by two methods was 27.89%(123/441)，which was higher than that of the single.ConclusionThe combined application of HCMV-IgM in the serum using ELISA and the copies of HCMV-DNA in urine using RT-PCR would raise the positive rate and reduce the missed diagnosis of detection for the patients with the human cytomegalovirus infection.

Key words:human cytomegalovirus;Serum;RT-PCR;ELISA

收稿日期：(2014-01-15)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R446.5

文章編號(hào)：1007-4287(2015)01-0078-03

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