細(xì)菌培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)在肺炎患兒細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

細(xì)菌培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)在肺炎患兒細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

譚文濤1，笪欣2

(1.新疆獨(dú)山子石化醫(yī)院 檢驗(yàn)科，新疆 克拉瑪依833600；2.新疆克拉瑪依中心醫(yī)院 感染科，新疆 克拉瑪依833600)

肺炎是兒童的一種最常見(jiàn)感染性疾病，多發(fā)生于嬰幼兒，是嬰兒死亡的主要原因。多發(fā)生于冬春寒冷季節(jié)和氣候驟變時(shí)，夏季也不例外。兒童患病后免疫力低下，容易發(fā)生再度感染。其主要臨床表現(xiàn)為驟發(fā)的發(fā)熱、嘔吐、咳嗽、氣促、煩躁及喘憋等癥狀[1,2]。該病大多數(shù)是因細(xì)菌感染引起，臨床上采用適當(dāng)?shù)目咕幙梢杂行У乜刂撇⒅斡摬?。但隨著近年來(lái)抗生素的廣泛使用和濫用，臨床上耐藥情況屢見(jiàn)不鮮，多種菌共同感染的現(xiàn)象逐漸增多[3]，兒童肺炎死亡率逐漸升高。臨床醫(yī)師為進(jìn)一步了解患兒肺炎感染的細(xì)菌譜，從而采取準(zhǔn)確的對(duì)因治療，常對(duì)患兒呼吸道分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以明確菌群，但培養(yǎng)技術(shù)存在時(shí)間長(zhǎng)、培養(yǎng)陽(yáng)性率低等缺陷而在臨床應(yīng)用上受到一定的限制[4]。目前，國(guó)際上出現(xiàn)了一項(xiàng)新技術(shù)-聚合酶鏈反應(yīng)在臨床上得到廣泛認(rèn)可。本研究旨在通過(guò)比較細(xì)菌培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)肺炎患兒細(xì)菌病原學(xué)的檢測(cè)價(jià)值，以期為臨床肺炎患兒的診療提供科學(xué)依據(jù)。

1資料和方法

1.1　一般資料

參照肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5，6]，選擇2009年8月至2013年6月本院收治住院的肺炎患兒180例，所有患兒年齡均<10歲，其中男性116例，女性54例，平均年齡(6.20±3.15)月。

1.2　試劑及儀器

試劑：0.9%生理鹽水、細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR試劑、細(xì)菌標(biāo)志性引物、一般培養(yǎng)基、流感嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基和肺炎鏈球菌選擇性培養(yǎng)基等；儀器：保溫箱、PCR儀、LuminexTM100懸浮陣列儀等

1.3　方法

1.3.1取樣及培養(yǎng)在患兒入院第二天清晨采集患兒呼吸道深部痰液，盛于無(wú)菌容器內(nèi)送檢。分別對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和篩查菌株(流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌)的選擇性培養(yǎng)，即將樣本分別接種于普通培養(yǎng)基、流感嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基和肺炎鏈球菌選擇性培養(yǎng)基中，于37℃條件下孵育24 h。

1.3.2聚合酶鏈反應(yīng)[7，8]將收集的患兒呼吸道痰液置于DNA提取試劑盒中提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等14種細(xì)菌的特異性引物。PCR反應(yīng)過(guò)程及條件分別為：變性(95℃、15 min)-退火(94℃、30 s)-延伸(52℃、1 min)，共35個(gè)循環(huán)。然后采用懸浮陣列方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的DNA含量。熒光強(qiáng)度中位值(MFI)大于250或值大于陰性結(jié)果的平均值加上5倍的標(biāo)準(zhǔn)差者即為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所得數(shù)據(jù)采用Epi data建立數(shù)據(jù)庫(kù),雙人錄入，計(jì)數(shù)資料間比較采取卡方分析。

2結(jié)果

2.1　常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

180個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性68個(gè)，共培養(yǎng)出70株細(xì)菌，總陽(yáng)性率為38.9%。

2.2　聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果

聚合酶鏈反應(yīng)共獲得90株細(xì)菌，總陽(yáng)性率為50.0%。

2.3　常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)比較

對(duì)不同菌種而言，聚合酶鏈反應(yīng)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的檢出率明顯高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)(P<0.05)；以任意一種方法檢測(cè)出陽(yáng)性即為陽(yáng)性標(biāo)本，檢出138株細(xì)菌，聯(lián)合陽(yáng)性率為76.7%(138/180)；檢測(cè)陽(yáng)性率前五位的菌株分別為流感嗜血桿菌(31.1%)、肺炎鏈球菌(18.3%)、大腸桿菌(7.2%)、鮑曼不動(dòng)桿菌(6.7%)和金黃色葡萄球菌(6.1%)，見(jiàn)表1。

3討論

細(xì)菌感染是致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染，臨床上以高熱、寒戰(zhàn)、皮疹和關(guān)節(jié)肌肉疼痛為主要特征，常見(jiàn)于老人、兒童、免疫功能低下等人群，嚴(yán)重者可發(fā)展為膿毒血癥或敗血癥[9]。肺部為細(xì)菌感染最容易侵入的部位，?？蓪?dǎo)致患者出現(xiàn)輕重不等的呼吸系統(tǒng)癥狀，如咳嗽、咳痰、氣促、呼吸衰竭等，為兒童時(shí)期最常見(jiàn)的疾病[10]。目前，臨床上可采用多種方法診斷細(xì)菌感染，如培養(yǎng)、分子生物學(xué)技術(shù)等，但每種方法都存在一定的使用限制。就細(xì)菌培養(yǎng)而言，雖然存在較高的特異性，但仍存在以下缺陷：①檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)臨床用藥指示性不強(qiáng)；②對(duì)那些要求嚴(yán)格或特別的細(xì)菌培養(yǎng)成功率較低；③檢測(cè)陽(yáng)性率受前期是否應(yīng)用抗生素的影響，若應(yīng)用抗生素，則細(xì)菌檢測(cè)陽(yáng)性率較低等[11]。隨著近年來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)菌分析的分子生物學(xué)技術(shù)嶄露頭角，其中聚合酶鏈反應(yīng)在臨床和科研中得到了廣泛應(yīng)用。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步一個(gè)周期，通過(guò)周期循環(huán)進(jìn)行，從而使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便和省時(shí)等特點(diǎn)[12]。與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)相比，具有準(zhǔn)確及時(shí)的優(yōu)勢(shì)，但每檢測(cè)一種細(xì)菌，需要制備相應(yīng)的特異性引物，增加了工作的繁雜度，同時(shí)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以從已死亡的菌種擴(kuò)增出DNA，使得聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在檢測(cè)病原體方面受到了諸多限制[13]。

表1　常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)聯(lián)合檢出結(jié)果

本研究通過(guò)對(duì)比分析培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)肺炎患兒呼吸道深部痰液細(xì)菌病原學(xué)的檢測(cè)情況發(fā)現(xiàn)，兩種方法檢測(cè)的細(xì)菌主要以肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌為主，說(shuō)明兒童肺炎致病菌以這兩種細(xì)菌為主。另外，聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)出的細(xì)菌種類雖然少于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，但其檢測(cè)陽(yáng)性率(50.0%)顯著高于常規(guī)培養(yǎng)(38.9%)，且聚合酶鏈反應(yīng)的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的檢出率明顯高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)(P<0.05)，說(shuō)明聚合酶鏈反應(yīng)和常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)在細(xì)菌檢測(cè)方面有各自的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)將兩種方進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率為76.7%，明顯高于任何一種方法，對(duì)不同細(xì)菌而言，聯(lián)合檢測(cè)流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和金黃色葡萄球菌檢測(cè)陽(yáng)性率最高，更進(jìn)一步說(shuō)明兒童肺炎感染的病原菌以此五種細(xì)菌為主，在臨床不明致病菌的情況下，可采用經(jīng)驗(yàn)治療，使用以上五種致病菌的敏感藥物。綜合以上結(jié)果可知，聚合酶鏈反應(yīng)和常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)在肺炎患兒病原菌診斷方面各有優(yōu)勢(shì)，聯(lián)合應(yīng)用可得到較高的檢測(cè)陽(yáng)性率。

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收稿日期：(2013-12-23)

作者簡(jiǎn)介：譚文濤(1972-)，男，本科學(xué)歷，主管技師，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面的研究。

文章編號(hào)：1007-4287(2015)01-0098-03