急性髓細胞白血病WHO分型及臨床意義

急性髓細胞白血病WHO分型及臨床意義

杜秀敏，陳英劍，孫子涵，胡成進*

(濟南軍區總醫院 實驗診斷科，山東 濟南250031)

傳統的FAB分型受檢驗者細胞層面認知局限性的限制，診斷準確率低，已遠遠不能滿足臨床的需求。因而在一些規模較大的實驗室，FAB分型已逐漸被WHO分型所取代。本研究對126例急性髓細胞白血病的WHO分型特征進行總結，并與FAB分型相比較，探討其細胞形態與免疫表型特征的關系，以助于提高我們對急性髓細胞白血病的實驗室診斷水平。

1資料和方法

1.1　一般資料

收集2007年9月-2013年9月共126例急性髓細胞白血病標本。男性72例，女性54例，年齡1歲-81歲，中位年齡37歲。所有患者均行骨髓細胞形態學、流式細胞術檢測。74例(50.8%)患者行染色體核型分析，32例(25.4%)患者行融合基因AML1-ETO及PML-RARα檢測。

1.2　儀器與試劑

瑞氏染色液為本實驗室自制。細胞過氧化物酶染色(POX)，糖元染色(PAS)及醋酸萘酚酯酶染色(NAE)試劑盒均系上海太陽生物技術公司產品。白血病免疫分型主要采用的抗體有髓系細胞系(CD13、CD33、CD14、CD15、cMPO)，B細胞系(CD10、CD19、CD20)，T細胞系(CD5、CD7)，干/祖細胞(CD34、CD38、HLA-DR)。單克隆抗體均系BD公司產品。流式細胞儀為美國BD公司FACS Calibur。

1.3　方法

1.3.1細胞形態學診斷按常規方法進行骨髓穿刺與涂片，一部分涂片行瑞氏染色，另一部分涂片行過氧化物酶染色(POX)、糖元染色(PAS)及醋酸萘酚酯酶染色(NAE)。油鏡下分類計數200個細胞，按FAB分型法對其進行急性白血病分型。

1.3.2細胞免疫分型取EDTA抗凝的患者骨髓或靜脈血1-2 ml備用。取100 μl(細胞數>106個)，分別加入相應的單克隆抗體20 μl，混勻后室溫避光放置15 min，加2 ml溶血素反應8 min，離心洗滌棄上清，懸浮細胞，上流式細胞儀檢測。檢測前用標準熒光微球校正熒光補償，CD45/SSC 雙參數散點圖設門，每管獲取10 000個細胞應用CELL-QUEST 軟件進行數據處理與分析。陽性判斷標準：以≥20%為陽性。免疫分型結果判讀參考我國診斷標準及歐美國家提倡的抗原積分標準[1]。

1.3.3染色體核型分析采集2 ml骨髓標本，用肝素抗凝，分離單個核細胞，培養24 h后，常規制備染色體標本，G顯帶技術顯帶，鏡下分析20個分裂相。按《國際人類細胞遺傳學國際命名法(ISCN) 2005》[2]進行核型分析。

1.3.4融合基因檢測取患者EDTA抗凝骨髓2 ml，用RT-PCR法或FISH法檢測AML1/ETO和PML-RARα融合基因，具體方法見文獻[3]。

2結果

2.1　細胞形態學分型

126例急性髓細胞白血病中，按FAB 分型標準M0 4 例，M1 8例，M2 18例，M3 14例，M4 22例，M5 37例，M6 6例，M7 1例，AML 10例，FAB不能分型6例。

2.2　細胞免疫分型

AML患者髓系抗原表達情況：按表達率高低依次為CD33(86.5%)、cMPO (85.7%)、 CD13(69.8%)、CD117(52.6%)、CD15(57.9%)、CD14(19.8%)；淋系抗原表達情況：本組資料中21.4%AML患者伴有淋系抗原表達，主要為：CD7 (10.3%)、CD19(6%)、CD10 (4.8%)、CD5(3.9%)；非系列特異性抗原表達情況：CD34(57.9%)、CD38(38.9%)、HLA-DR(44.4%)；M3患者中缺乏CD34、HLA-DR表達，CD14在M4或M5中的表達率明顯高于其他亞型。

2.3　染色體核型分析

74例AML患者中26例染色體核型正常，占35.1%；異常核型48例，異常核型檢出率64.9%，其中AML伴重現性遺傳學異常31例，占41.9%，包括t(8;21)易位14例(18.9%)、t(15;17)易位10例(13.5%)、inv(16)倒位4例(6.3%)和11q23異常3例，其他異常核型17例(22.9%)。t(8;21)易位主要見于M2，inv(16)主要見于M4，而t(15;17)易位僅見于M3亞型。

2.4　融合基因檢測

32例AML患者分別行AML1-ETO及PML-RARα融合基因分析：AML1-ETO共檢測19例(M2 15例，M4 3例，M3 1例)，陽性10例見于M2患者，另2例見于M4，占M2的66.7%；PML-RARα共檢測14例(M3 10例，M5 2例，M2 2例)，陽性9例均見于M3患者，占M3的90%。

2.5　FAB分型與WHO分型的比較

FAB分型中有5例與WHO分型不符：2例M3和1例M1為AML伴t(8;21)(q22;q22) (AML1/ETO)(FAB M2)；1例M0為AML伴t(15;17)( q22;q12)(PML/RARα)(FAB M3)；1例M2為雙表型急性白血病(BAL)。FAB不能分型的6例急性白血病，后經免疫分型、染色體核型分析及融合基因檢測證實：2例為M0，1例為proB-ALL，1例為M1，2例為BAL(髓系和T細胞標志共表達)，FAB診斷符合率91.3%(115/126),見表1。

表1　患者FAB分型與WHO分型的比較

3討論

骨髓細胞形態學和細胞化學染色技術是診斷急性白血病的基礎，但對于微分化型及一些形態學不典型的急性白血病，其診斷具有一定的局限性。隨著流式細胞免疫分型技術、細胞遺傳學和分子生物學技術的不斷發展，以MICM分型技術為基礎的WHO診斷標準在國內外逐漸普及完善，提高了急性白血病診斷的準確性及客觀性。在“WHO造血組織和淋巴組織腫瘤分類方案(2001)”中對AML所作的主要修改有：1)將診斷AML的原始細胞下限降低為20%；2)將伴有重現性細胞遺傳學異常、有多系發育異常以及此前有放、化療病史或有先期MDS的AML獨立單列；3)強調有重現性細胞遺傳學異常者，雖原始細胞<20%也應診斷為AML，而不診斷為MDS；4)將M6細分為M6a和M6b。

在WHO分類方案中，免疫分型仍然起著決定性的作用。研究發現，POX<3%的AML細胞形態學診斷與免疫細胞化學結果的診斷吻合率僅為53.3%，此類白血病在細胞形態學上表現復雜，必須依賴于免疫分型才能確診[4]。本組126例急性髓白血病患者免疫學分型與形態學分型比較發現，免疫分型對M3和急性單核細胞白血病的的確診起著關鍵作用。CD14是單核細胞較特異的表面標志，其在M4或M5中表達較高，故有助于M4或M5與其它亞型的鑒別診斷；CD34和HLA-DR是干祖細胞標志，極少在M3患者表達。而進一步的細胞遺傳學分析和融合基因檢測則對M3和M2分型的鑒別診斷起著至關重要的作用。

本組病例中，AML1-ETO融合基因陽性多見于M2患者，而PML-RARα陽性僅見于M3患者，且均與特征性的染色體核型異常有較高的一致性：具t(8;21)易位的AML常見于M2，易位產生了AML1/ETO融合蛋白，導致粒系和粒單細胞系發育的關鍵調控子C/EBP-α和PU.1的失調[5]；而t(15;17) 易位則是M3的典型遺傳學特征，它導致位于17q12的RARα基因與PML編碼序列相連，產生PML-RARα融合蛋白，這類易位在APL中占99%[6]，說明此類融合基因及其特征性的染色體核型在其臨床診斷中的重要性。近年來，越來越多的研究證明染色體核型可以作為AML的獨立預后因素，它在一定程度上決定著急性白血病患者的診療及預后。研究發現，約52%的AML具有染色體異常，可分為兩種類型：一種是具有平衡易位的AML，如 t(8;21)，t(15;17)和inv16；另一種是不平衡易位如5q-,7q-,-5,-7和復雜核型的AML。在平衡易位中，常見的染色體特殊亞型為急性早幼粒(APL)中的t(15;17) 易位或伴有成熟的急性髓細胞白血病(AML-M2)中的t(8;21)易位，它們與良好的預后相關[7]。在染色體不平衡易位中染色體的全部或部分丟失占優勢，尤其是5、7和17號染色體，經常增多的是8號染色體[8]。具有不平衡易位的AML預后較差，僅有10%-15% 的長期生存者[9]。因而染色體易位、易位導致的相關基因的鑒定及異常融合蛋白的識別揭示了不同AML亞型間的生物學意義，有助于患者的個體化診療。

本組病例中檢出AML伴多系發育異常9例，包括此前有MDS 病史7例及無MDS 2例，此類患者多為伴有復雜核型的AML，預后不良，難治易復發。其骨髓涂片中易見多系發育異常，常可見淋巴樣小巨核細胞。因而對于此類病人及早進行染色體核型分析，對于治療方案的選擇極為重要。與WHO分型相比較，本組病例的形態學診斷符合率僅為91.3%(115/126)，其形態學易誤診的為M2，在這幾例M2患者的骨髓涂片中均出現較高比例的早幼粒細胞，且原始粒細胞胞漿多顆粒(Ⅲ型原粒多見)，因而易誤診為M3。但進一步的檢測發現，特征性的染色體異常t(8;21)易位及融合基因AML1/ETO陽性、PML-RARα陰性使其與M3相區別。故有學者提出在早幼粒細胞比例較高時，若原粒細胞大于10%，診斷M3應慎重[10]，此時應進行免疫分型、細胞遺傳學分析及融合基因檢測以確診。形態學不能分型的6例急性白血病，后經免疫分型、染色體核型分析及融合基因檢測證實：2例為M0，1例為M1，2例為雙表型急性白血病(髓系和T細胞標志共表達)，1例為混合細胞型白血病(單核細胞和T細胞)。由此可見，免疫分型對微分化型、雙表型或混合型急性白血病的診斷有著不可替代的優勢。

目前，隨著對急性白血病研究的深入和分子診斷水平的提高，越來越多的髓系抗原陽性的ALL(My+ALL)、淋系抗原陽性的AML(Ly+AML)、雙系列或雙表型急性白血病被發現，此類白血病的臨床表現及預后均與單純的淋系或粒系不同，因而免疫分型對急性白血病的個性化診療起著重要作用。尤其是隨著對急性髓細胞白血病發生發展過程中細胞遺傳學及分子生物學機制研究的深入，針對AML特異性靶向藥物在臨床的開展應用，傳統的FAB分型已遠不能滿足臨床的需求，以細胞形態為基礎，免疫分型、細胞遺傳學分析及分子生物學基因檢測等多手段聯合的WHO分類方案的發展與應用，必將推動白血病臨床個性化診斷與治療的進展，使其實驗室診斷更為準確可靠，并為其靶向基因治療提供分子依據。

參考文獻：

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收稿日期：(2013-12-26)

文章編號：1007-4287(2015)01-0136-03

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