磷酸化Smad3在神經元樣細胞氧糖剝奪中的表達變化

徐仲航,王一鳴,王勇濤,王姣琦,何金婷,莽　靖*,邵延坤* ,徐忠信

(1.吉林大學白求恩醫學部臨床醫學院，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科，吉林 長春130033)

磷酸化Smad3在神經元樣細胞氧糖剝奪中的表達變化

徐仲航1,王一鳴1,王勇濤1,王姣琦2,何金婷2,莽靖2*,邵延坤2*,徐忠信2

(1.吉林大學白求恩醫學部臨床醫學院，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科，吉林 長春130033)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0523)

研究發現，激活素A(ActivinA，ActA)作為轉化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)超家族的成員之一，主要通過ActA/Smads 信號轉導通路在缺血性腦損傷中發揮神經保護作用[1,2]。本研究利用PC12 神經元樣細胞OGD模型體外模擬神經細胞缺血性損傷[3]，動態檢測OGD不同時間磷酸化Smad3蛋白表達變化，以期明確腦缺血損傷中ActA/Smads通路細胞內信號轉導模式。

1材料和方法

1.1　主要材料

大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自北京金紫晶生物醫藥技術有限公司。兔抗大鼠磷酸化Smad3抗體購自美國ThermoFisher公司，小鼠抗大鼠β-actin抗體購自美國Santa公司，兔抗大鼠NSE抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗，FITC標記的羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2　 實驗方法

1.2.1PC12細胞培養使用含10%馬血清，10%胎牛血清的高糖DMEM培養液于37℃含5%CO2飽和濕度的培養箱中培養PC12細胞。培養液每2-3天更換一次，細胞接近80%融合時用0.25%胰酶進行常規消化傳代。

1.2.2神經元樣PC12細胞的誘導及鑒定采用本研究前期實驗方法，應用NGF誘導PC12細胞為神經元樣細胞并采用NSE免疫熒光染色進行鑒定。

1.2.3神經元樣細胞OGD模型建立采用本研究前期實驗方法，應用終濃度為1.0 mmol/L Na2S2O4無糖DMEM培養液建立神經元樣細胞體外OGD模型。

1.2.4MTT細胞存活率檢測將PC12細胞以1×104/孔接種于96孔細胞培養板，次日細胞貼壁后分別用OGD處理0、3、6、12 h。隨后輕輕吸除無糖DMEM培養液，再加入含10 μl 5 mg/ml MTT的正常培養液，37℃孵育4 h后棄去培養液，加入100 μl二甲基亞砜溶解藍紫色結晶，振蕩溶解后使用酶標儀在490 nm處測定吸光度(A)，每組細胞測定4復孔。實驗重復三次，根據測定的每組細胞吸光度值(A)與OGD 0 h的吸光度值(A)進行比較，計算各組細胞的存活率，公式如下：

細胞存活率(%)=

1.2.5Western blot磷酸化Smad3蛋白水平的表達檢測使用RIPA裂解液分別提取上述四組細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度以調整上樣量。經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后將 PVDF 膜放入雜交袋中，分別用兔抗大鼠磷酸化Smad3(p-Smad3)(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1000)4℃ 孵育過夜。次日TBST洗膜后用辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠或羊抗兔二抗(1∶1000)室溫孵育1 h后ECL顯影壓膠片。凝膠圖像分析系統掃描膠片，ImageJ軟件灰度分析后通過計算目的條帶與其對應的內參條帶的比值來表示目的蛋白的表達水平。

1.3　統計學分析

2結果

2.1　NSE免疫熒光染色

正常的PC12細胞為圓形，呈半懸浮狀態，容易聚集成團，經NGF誘導分化的神經元樣PC12細胞呈星形并帶有較長突起，NSE免疫熒光染色后激光共聚焦觀察，在藍色激發光下呈現綠色熒光的胞體為高表達NSE，紫色激發光下可見呈藍色熒光的復

染細胞核，表明NGF誘導分化的PC12細胞NSE高表達。

2.2　細胞存活率檢測

經OGD處理3h后PC12細胞的存活率顯著降低，為63.7%，與OGD0h相比差異有統計學意義(P<0.05)，至OGD12h，其存活率降為54.7%，說明OGD可成功模擬神經細胞缺血性損傷，見圖1。

*與OGD0 h比較P<0.05

2.3　磷酸化Smad3蛋白檢測

OGD處理3h后磷酸化Smad3的表達較OGD0h時升高，至OGD12h時明顯降低(圖2)。

圖2　磷酸化Smad3蛋白檢測

3討論

近期研究發現，ActA作為一種神經營養因子，在中樞神經系統內存在表達，并在腦組織缺血缺氧性損傷中發揮著早期神經保護功能[4,5]。作為第一信使，激活的ActA首先與細胞膜TGF-βII型受體結合，磷酸化激活TGF-βI型受體，繼而募集活化下游R-Smads。在ActA/Smads信號通路中磷酸化Smad2/3與Smads錨著蛋白(Smadanchorforreceptoractivation,SARA)分離，并與Smad4形成Smad2/4和Smad3/4復合物。上述異二聚體進而轉入細胞核與DNA結合，調控靶基因表達，并完成ActA/Smads通路的跨膜信號轉導[6,7]。通常認為，在這一信號轉導過程中，雖然Smad2與Smad3為兩種不同蛋白，但其作用相同。在缺血性腦損傷中，有研究發現存在Smad2磷酸化水平的升高，但作為ActA/Smads信號通路發揮生物學功能的關鍵位點，Smad3的表達變化尚不清楚。

本研究利用OGD模型體外模擬神經細胞缺血性損傷，經MTT驗證模型成功后檢測磷酸化Smad3在OGD各時間點的表達情況。結果發現在OGD早期即OGD3h時即發生磷酸化Smad3表達升高，并持續至OGD6h，到OGD12h降低，研究結果一方面再次證實了缺血性腦損傷可誘導細胞內的Smads途徑激活，這與本課題前期研究和國外其他研究結論一致[1,2]；另一方面，也證實了Smad2與Smad3在ActA/Smads信號通路的激活過程中所起的作用是一致，細胞內磷酸化Smad3表達水平可作為ActA/Smads通路早期活化過程的標志。進一步針對其核內調控位點的研究將為神經細胞缺血性損傷后ActA/Smads通路的神經保護機制及缺血性腦損傷的治療提供新的啟示。

參考文獻：

[1]MukerjiSS,KatsmanEA,WilberC,etal.Activinisaneuronalsurvivalfactorthatisrapidlyincreasedaftertransientcerebralischemiaandhypoxiainmice[J].JCerebBloodFlowMetab,2007,27(6):1161.

[2]MangJ,MeiC-L,WangJ-Q,etal.EndogenousProtectionDerivedfromActivinA/SmadsTransductionLoopStimulatedviaIschemicInjuryinPC12Cells[J].Molecules,2013,18(10):12977.

[3]LiCT,ZhangWP,LuYB,etal.Oxygen-glucosedeprivationactivates5-lipoxygenasemediatedbyoxidativestressthroughthep38mitogen-activatedproteinkinasepathwayinPC12cells[J].JNeurosciRes,2009,87(4):991.

[4]WangJQ,HeJT,DuZW,etal.EffectsofSARAonoxygen-glucosedeprivationinPC12cellline[J].NeurochemRes,2013,38(5):961.

[5]HeJin-Ting,MangJing,MeiChun-Li,etal.NeuroprotectiveEffectsofExogenousActivinAonOxygen-GlucoseDeprivationinPC12Cells[J].Molecules,2011,17(1):315.

[6]ShiY,MassagueJ.MechanismsofTGF-betasignalingfromcellmembranetothenucleus[J].Cell,2003,113(6):685.

[7]SchmiererB,HillCS.TGFbeta-SMADsignaltransduction:molecularspecificityandfunctionalflexibility[J].NatRevMolCellBiol,2007,8(12):970.

摘要：目的探討磷酸化Smad3蛋白在神經元樣PC12細胞氧糖剝奪中的表達變化。方法利用鼠神經生長因子(NGF)誘導大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)向神經元樣細胞轉化，應用無糖DMEM培養液聯合連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)構建氧糖剝奪模型(oxygen-glucose deprivation，OGD)，體外模擬神經元缺血性損傷。MTT檢測神經元樣細胞OGD 0，3，6和12 h存活率，Western blot檢測OGD 前后磷酸化Smad3蛋白表達。結果成功建立神經元樣PC12細胞的OGD模型；OGD 3 h后細胞存活率顯著下降，至OGD 12 h降至最低54.7%；細胞內磷酸化Smad3表達在OGD 3、6 h與OGD 0 h組相比略升高，至OGD 12 h時明顯降低。結論磷酸化Smad3參與在神經元樣細胞OGD早期ActA/Smads通路的活化。

關鍵詞：ActA/Smads；磷酸化Smad3；OGD

Changes of Smads mRNA in nerve-like cells after OGD injuryXUZhong-hang,WANGYi-ming,WANGYong-tao,etal. (NormanBethuneHealthCenterofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore changes of phosphorylated Smad3(p-smad3) expression in neuron-like PC12 cells after oxygen-glucose deprivation(OGD).MethodsRat nerve growth factor (NGF) was used to induce the differentiation of rattus PC12 pheochromocytoma cells to neuron-like cells.Na2S2O4 and glucose-free DMEM were introduced to perform an OGD model.The survival rate of cells suffered by OGD was examined by MTT assay.And the protein expression of p-smad3 measured by Western blot.ResultsPC12 cells were successfully differentiated into neuron-like cells after NGF exposure.The survival rate of cells were dramatically decreased after 3h of OGD exposure,and reached to its lowest point at 12h.Compared with OGD 0h,expression of p-Smad3 was slightly increased after 3 or 6 h,and significantly decreased at 12h.Conclusionp-Smad3 took part in the activation of ActA/Smads signaling in response to early time of OGD treatment.

Key words:ActA/Smads；phosphorylated Smad3；OGD

收稿日期：(2014-08-30)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R743.3

文章編號：1007-4287(2015)04-0523-03

通訊作者*

基金項目：國家自然基金面上項目(81371298);吉林省科技發展計劃國際合作項目(20120723);吉林省產業技術研究與開發項目(2013C030-4);吉林大學大學生國家級創新基金項目(2014A79339)