Smad4介導Activin A 信號在PC12細胞OGD損傷中作用研究

尤如芹，王姣琦，劉洪雨，崔　楊，何金婷，紀秋野，劉永峰，莽　靖*，徐忠信*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 a.神經內科;b.科學研究中心，吉林 長春130033；2.美國奧爾巴尼醫學院)

Smad4介導Activin A 信號在PC12細胞OGD損傷中作用研究

尤如芹1a，王姣琦1a，劉洪雨1a，崔楊1a，何金婷1a，紀秋野1b，劉永峰2，莽靖1a*，徐忠信1a*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 a.神經內科;b.科學研究中心，吉林 長春130033；2.美國奧爾巴尼醫學院)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0525)

目前研究認為ActA 在中樞神經系統存在表達。缺血性腦損傷后，其分泌增加，并以靶源性方式作用于神經細胞，激活ActA/Smads信號轉導通路，繼而發揮神經保護功能[1,2]。基于其他系統組織或疾病背景下的研究證實Smad4可能通過從細胞質向細胞核內的遷移而介導ActA下游信號，但在缺血性腦損傷中尚未得到證實。本研究應用神經元樣PC12細胞的OGD模型體外模擬腦缺血損傷，利用免疫熒光染色結合激光共聚焦顯微鏡對Smad4的質核分布進行檢測，以明確Smad4在介導PC12細胞OGD損傷中ActA 信號轉導的模式及作用。

1材料和方法

1.1　主要材料

大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自金紫晶生物醫藥技術有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、鼠神經生長因子(NGF)購自美國Sigma公司。連二亞硫酸鈉購自上海鼎國生物技術有限公司。Triton X-100購自上海碧云天生物技術有限公司。兔抗大鼠Smad4一抗購自美國Abcam公司，Cy3標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1PC12細胞培養及神經元樣轉化正常PC12細胞常規培養在含10 %胎牛血清和10 %馬血清的高糖DMEM培養液中，并于37 ℃，5 % CO2培養箱中飽和濕度培養。細胞接近70 %融合時更換為含NGF(終濃度50 ng/ml)的培養液，連續刺激5天，以誘導細胞神經元樣轉化[3]。

1.2.2PC12細胞氧糖剝奪模型建立取生長狀態良好的神經元樣PC12細胞，用無糖DMEM培養液輕輕沖洗3次，而后用含10 %胎牛血清和終濃度1.0 mmol/L連二亞硫酸鈉的無糖DMEM培養液于37℃孵箱內的缺氧罐中進行氧糖剝奪(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)處理[4]。計時0 h和3 h建立神經元樣PC12細胞OGD 0 h和3 h組。

1.2.3Realtime-PCR檢測ActA mRNA表達水平Premier 5.0 軟件根據Genbank檢索的核苷酸序列設計ActA引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：U:5′-TAG TTT ACC TGG GAT GAA GC -3′；D:5′-TAG CAC CCT CTA ACA CCT CT -3′。根據之前描述的方法于OGD不同時間點應用SYBR Green法行Real-time PCR 檢測[4]。

1.2.4激光共聚焦觀察Smad4的質核分布以4×104/密度將PC12細胞接種于預先放有細胞爬片的24孔細胞培養板。次日細胞貼壁后加入NGF(終濃度50 ng/ml)，連續誘導5 d。繼而OGD處理0 h、3 h、6 h、12 h后挑出細胞爬片，0.3% Triton X-100處理20 min，PBS浸洗后，2 % BSA封閉30 min，而后滴加Smad4一抗(1∶500)4℃濕盒中過夜孵育。避光條件下加入Cy3標記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h后進行DAPI(1 μg/ml)染色，37℃避光孵育15 min，梯度脫水后防淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡554 nm下觀察Smad4的質核分布情況。

2結果

2.1　PC12細胞的神經元樣轉化

正常PC12細胞為圓形或橢圓形，呈半懸浮狀態，易聚集成團。經NGF連續誘導5 d后，細胞貼壁，停止分裂生長并伸出較長的突觸，呈神經元樣。

2.2　ActA mRNA 表達變化

神經元樣PC12細胞OGD 3h ActA mRNA相對表達量(1.86±0.08)較0 h顯著增高(P<0.05)；OGD 6h表達量(0.65±0.07)及OGD 12h(0.57±0.06)表達量逐漸下降(圖1)，與OGD 3h比較，差異顯著(P<0.05)。

注：*與OGD 0h組比較P<0.05，△與OGD 3h組比較P<0.05

2.3　Smad4的質核分布比較

激光共聚焦顯微鏡554 nm的激發光下Cy3標記的Smad4呈紅色熒光，細胞核經DAPI復染后呈藍色。融合后圖像顯示，OGD 3 h分布于細胞核內Smad4蛋白數量較OGD0h顯著增多，OGD 6h開始逐漸下降，OGD12 h達最小值。

3討論

近期研究發現，作為轉化生長因子β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族的成員之一，ActA具有抗缺血性損傷，促進神經功能恢復的功能[2,8]。ActA作為一種細胞外的信號啟動因子，其信號轉導主要依靠Smad蛋白家族介導，但目前其參與腦缺血損傷與修復的信號轉導機制尚未完全闡明。

課題組前期研究證實，與經典的ActA信號轉導通路一致，在腦缺血損傷誘導的ActA信號激活過程中，細胞外的ActA通過與跨膜受體結合，磷酸化激活下游的Smad2/3[3]。基于其他系統組織或疾病背景下的研究證實Smad4可能通過從細胞質向細胞核內的遷移而介導ActA下游信號[5]，但在缺血性腦損傷中尚未得到證實。本研究應用神經元樣PC12細胞的OGD模型體外模擬腦缺血損傷，利用免疫熒光染色結合激光共聚焦顯微鏡對Smad4的質核分布進行檢測，以明確Smad4在介導PC12細胞OGD損傷中ActA 信號轉導的模式及作用。結果顯示：神經元樣PC12細胞OGD3 h ActA mRNA相對表達量較0 h顯著增高；OGD6 h表達量及OGD12 h表達量逐漸下降。OGD 3 h分布于細胞核內Smad4蛋白數量較OGD0h顯著增多，OGD6 h開始逐漸下降，OGD12 h達最小值。研究結果一方面進一步證實了缺血損傷可誘導神經細胞ActA信號激活，與課題組前期的體內外研究結果相一致[4,8]；而另一方面，本研究結果也提示了在腦缺血損傷這一病理及病理生理過程中，被誘導激活的ActA信號強度呈動態變化過程，即其在缺血早期可能介導了短時程的腦保護信號。

腦組織對缺血性損傷十分敏感，腦局部血流中斷5 min即會出現腦組織不可逆性損傷[6,7]，因此，本研究結果可能對為缺血性腦卒中的治療贏得時間，從而改善腦梗死患者預后，提高生活質量具有重要意義。另外，本研究結果證實了Smad4在介導ActA信號從細胞質到細胞核轉導的模式，檢測方法具有一定創新性。如用傳統的Western-blot蛋白檢測技術，需單獨提取核蛋白，工作復雜。本研究采用免疫熒光染色技術對Smad4(Cy3)及細胞核(DAPI)進行不同標記，在激光共聚焦顯微鏡下對Smad4的空間位移進行半定量檢測，方法簡便易行，提高了檢測效率及準確性。

綜上，本研究證實了OGD損傷可誘導神經元樣PC12細胞ActA信號激活，Smad4可通過質核移位介導ActA 信號在受體水平下游的信號轉導，且隨時間延長呈動態變化，實驗結果擴展了腦缺血損傷相關ActA信號轉導機制的研究思路。但本研究為體外細胞水平實驗研究，與體內真實環境尚存在一定差距，尚需在后續研究中豐富體內實驗結果。

參考文獻：

[1]Mang J,Mei C-L,Wang J-Q,et al.Endogenous Protection Derived from Activin A/Smads Transduction Loop Stimulated via Ischemic Injury in PC12 Cells [J].Molecules,2013,18(10):12977.

[2]Mukerji SS,Katsman EA,Wilber C,et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice [J].Cereb Blood Flow Metab,2007,27(6):1161.

[3]Mei Chun-li,He Jin-ting,Mang Jing,et al.Nerve growth factor (NGF) combined with oxygen glucose deprivation OGD induces neural ischemia tolerance in PC12 cells [J].African Journal of Biochemistry Research,2011,5(10):315.

[4]莽靖，何金婷，王嬌琦，等.腦缺血損傷ActA與跨膜受體ActRIIA在Smads轉導通路中的表達[J].中風與神經疾病雜志，2013,30(1):15.

[5]Heldin CH,Miyazono K,ten Dijke P.TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J].Nature，1997，390(6659):465.

[6]Dirnagl U,Iadecola C,Moskowitz MA.Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view [J].Trends Neurosci，1999，22(9):391.

[7]Broughton BR,Reutens DC,Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia [J].Stroke，2009，40(5):e331.

[8]He Jin-Ting,Mang Jing,Mei Chun-Li,et al.Neuroprotective Effects of Exogenous Activin A on Oxygen-Glucose Deprivation in PC12 Cells [J].Molecules,2011,17(1):315.

摘要：目的明確OGD損傷誘導的PC12細胞激活素A(Activin A， ActA)信號在細胞內基于Smad4的轉導模式及作用。方法使用鼠神經生長因子(NGF，50 ng/ml)誘導大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞向神經元樣轉化，利用無糖DMEM培養液聯合連二亞硫酸鈉(1 mmol/L)構建神經元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，體外模擬神經元缺血性損傷。OGD 0、3 h、6 h、12 h后Realtime-PCR檢測ActA mRNA表達水平；激光共聚焦觀察免疫熒光染色后的Smad4質核分布情況。結果NGF誘導后PC12細胞貼壁并伸出較長的突觸，向神經元樣轉化。細胞OGD處理3 h后ActA mRNA表達水平較0 h顯著升高，6 h開始下降；OGD3 h后Smad4在細胞核內的分布較OGD 0 h明顯增加，6小時開始下降。結論OGD損傷可誘導神經元樣PC12細胞ActA信號激活，Smad4可通過質核移位介導ActA 信號在受體水平下游的信號轉導，且隨時間延長呈動態變化。

關鍵詞：腦缺血損傷；激活素A；Smad4

Effects of ActivinA signaling mediated by Smad4 in PC12 cell suffered by OGDYOURu-qin,WANGJiao-qi,LIUHong-yu,etal.(DepartmentofNeurology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the transduction mechanisms and function of the ActivinA (ActA)signaling based on Smad4 in the oxygen-glucose deprivation (OGD) PC12 cell line.MethodsNerve growth factor (NGF,50ng/ml) was used in this study to induce the differentiation of rattus PC12 pheochromocytoma cells to nerve-like cells.Then the glucose-free DMEM and hyposulfite of Na2S2O4(1 mmol/L) was introduced to cells to construct an OGD model in vitro.The expression of ActA mRNA in OGD 0 h/3 h/6 h/12 h group was abserved by Realtime-PCR.And after immunofluorescence staining,the intranuclear mobility of Smad4 in OGD 0 h/3 h/6 h/12 h group was observed under the confocal laser scanning microscope at 554 nm.ResultsPC12 cell was successfully differentiated into nerve-like cell after NGF exposure.Compared to the group of OGD 0 h，the expression of ActA mRNA in OGD 3 h group was significantly increased，while gradually decreased in OGD 6 h and 12 h group.The fluorescence intensity of Smad4 in nuclei was increased in OGD 3 h group compared to that in OGD 0 h group,and decreased in OGD 6h group.ConclusionOGD injury could activate the ActA signaling in nerve-like PC12 cell line.Smad4 could mediate the tranduction of ActA signaling through cytoplasmic-nuclear translocation.

Key words:Brain ischemia;Activin A;Smad4

收稿日期：(2014-09-24)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R743.3

文章編號：1007-4287(2015)04-0525-04

通訊作者*

基金項目：國家自然基金面上項目(81371298)；吉林省科技發展計劃國際合作項目(20120723);吉林省產業技術研究與開發項目(2013C030-4);吉林大學白求恩前沿交叉學科創新項目(2013107028);吉林大學白求恩醫學青年科研基金項目(2013207052)