Noggin基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)局灶性腦缺血的研究

吳成吉，晉學(xué)飛，王　璇，魏春杰，鄒春穎*，張曉梅，董淑欣

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)四科，黑龍江 佳木斯154000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春130000)

Noggin基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)局灶性腦缺血的研究

吳成吉1，晉學(xué)飛2，王璇1，魏春杰1，鄒春穎1*，張曉梅1，董淑欣1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)四科，黑龍江 佳木斯154000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春130000)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0540)

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)作為神經(jīng)組織生長(zhǎng)發(fā)育及損傷修復(fù)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診治中受到廣泛關(guān)注。研究已證實(shí)腦內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞可對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷起到有效修復(fù)作用,然而單純的神經(jīng)干細(xì)胞移植在復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的療效欠佳，近年來(lái)神經(jīng)干細(xì)胞移植與基因治療聯(lián)合應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病逐漸成為新的研究方向。本研究通過(guò)將Noggin基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植入大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠腦組織，探討其在局灶性腦缺血治療上的功效。

1材料與方法

1.1材料清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，質(zhì)量(240±20)g。Neurobasal培養(yǎng)液、5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)購(gòu)自Gibco公司，鼠抗BrdU單抗、羊抗鼠IgG-FITC購(gòu)自上海生工生物工程有限公司、鼠立體定向儀購(gòu)自德國(guó)KOPF公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)取新生SD胎鼠腦組織經(jīng)D-Hanks液漂洗，充分剪碎，反復(fù)用吸管吹打，經(jīng)濾過(guò)網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，接種于Neurobasal培養(yǎng)液，接種密度為1×106個(gè)/ml，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，每3 d半量換液，每7 d傳代一次。

1.2.2大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞(MCAO)模型的建立對(duì)SD大鼠行10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，取頸正中切口暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈。遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，其近端置入4-0尼龍線經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈2 h，拔除尼龍線縫合皮膚。模型建立后給予20 kU慶大霉素腹腔內(nèi)注射。

1.2.3動(dòng)物分組及移植前神經(jīng)損害程度評(píng)分(NSS)建立MCAO模型后3 d，依照NSS量表12項(xiàng)指標(biāo)對(duì)所有大鼠進(jìn)行NSS評(píng)分，功能完全正常記為0分,功能完全喪失記為16分。每只大鼠評(píng)分兩次取平均值。隨機(jī)數(shù)表法分成3組，其中對(duì)照組10只，神經(jīng)干細(xì)胞移植組、Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組各20只。

1.2.4神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志和移植以10 μmol/L的BrdU標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞及Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞，若形成神經(jīng)球則再次分離吹打，離心并去上清液。建立模型后3 d，用鼠立體定向儀固定MCAO大鼠，常規(guī)消毒后取頭皮正中切口，選取前囟近尾端0.8 mm，正中線旁1.2 mm，深度3.0 mm處為側(cè)腦室移植點(diǎn)，經(jīng)微量注射器分別緩慢注入對(duì)照組10 μL PBS，神經(jīng)干細(xì)胞移植組注入10 μL空白神經(jīng)干細(xì)胞懸液，Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組注入10 μL經(jīng)Noggin基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞懸液。

1.2.5移植后神經(jīng)損害程度評(píng)分移植后7 d、14 d、21 d再次按相同方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行NSS評(píng)分，分值越高表示神經(jīng)損害程度越嚴(yán)重。

1.2.6測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞的遷移分布建立模型后25d將各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，插入灌注針頭并剪開(kāi)右心耳，注入4℃生理鹽水至流出液澄清繼續(xù)灌注200 mL多聚甲醛磷酸鹽緩沖液。斷頭取腦置于此固定液24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片。免疫組化染色采用SABC-DAB法，常規(guī)脫蠟水化、PBS沖洗后滴加封閉液20 min。室溫下滴加鼠抗BrdU單抗1 h，PBS沖洗后滴加羊抗鼠IgG-FITC 20 min，PBS沖洗后滴加SABC顯色試劑。在×400鏡下隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊視野，以胞漿出現(xiàn)棕色為陽(yáng)性染色細(xì)胞，計(jì)算每張切片的平均細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)小圓型原代細(xì)胞密度均勻地懸浮生長(zhǎng)，2 d開(kāi)始自身克隆并逐漸增大，4 d時(shí)部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞增殖并聚集成大小不等的球形團(tuán)塊。7 d時(shí)已形成邊界清晰、折光性良好的神經(jīng)球。原代培養(yǎng)7 d后再次機(jī)械分離神經(jīng)球，制成單細(xì)胞懸液繼續(xù)傳代，細(xì)胞健康飽滿，狀態(tài)良好。

2.2移植前后各組大鼠神經(jīng)損害程度評(píng)分對(duì)照組(7.9±1.5)分，神經(jīng)干細(xì)胞移植組(8.1±1.3)分，Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組(8.0±1.2)分，各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.58，P>0.05)。細(xì)胞移植后各組NSS評(píng)分均呈下降趨勢(shì)，Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組評(píng)分較對(duì)照組及神經(jīng)干細(xì)胞移植組低，第7 d顯著低于對(duì)照組，第14 d、21 d顯著低于對(duì)照組及神經(jīng)干細(xì)胞移植組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.27，P<0.05)(表1)。

表1　移植后各組大鼠神經(jīng)損害程度評(píng)分

注：與對(duì)照組相比*P<0.05；與神經(jīng)干細(xì)胞移植組相比△P<0.05

2.3測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞的遷移分布神經(jīng)干細(xì)胞移植組和Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組見(jiàn)棕色BrdU陽(yáng)性細(xì)胞以移植點(diǎn)為中心向四周分布。Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組可見(jiàn)大量存活移植細(xì)胞，分布范圍較神經(jīng)干細(xì)胞移植組廣泛，并向缺血區(qū)域周邊組織遷移。BrdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組(126.8±5.46)個(gè)/HP，多于神經(jīng)干細(xì)胞移植組(85.5±4.7)個(gè)/HP，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.35，P<0.05)。神經(jīng)干細(xì)胞移植組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞主要聚集于移植區(qū)域，少量移植細(xì)胞穿過(guò)胼胝體移向健側(cè)。移植細(xì)胞與受體組織未見(jiàn)明顯排異反應(yīng)，組織相容性較好。

3討論

神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)自我更新和維持，具有多向分化性，使其攜帶的基因在體內(nèi)長(zhǎng)期存在及表達(dá)，且具有方便取材、克隆培養(yǎng)、易于保存及移植等優(yōu)點(diǎn)，因而成為基因治療的理想載體靶細(xì)胞[1]。神經(jīng)元軸突或胞體受損常導(dǎo)致神經(jīng)元退化甚至死亡,造成永久性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。損傷誘導(dǎo)局部組織或全腦產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌、血管及星型膠質(zhì)細(xì)胞增生、抑制興奮性氨基酸的毒性作用等起到神經(jīng)保護(hù)及損傷修復(fù)作用[2,3]。神經(jīng)干細(xì)胞攜帶目的基因移植到靶組織后表達(dá)目的基因，生成細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)誘導(dǎo)干細(xì)胞生長(zhǎng)分化，發(fā)揮細(xì)胞替代、組織重建的作用[4]。近年來(lái)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷以逐漸代替3H-胸腺嘧啶標(biāo)記細(xì)胞，成為研究神經(jīng)元發(fā)生的新標(biāo)記物。BrdU與3H-胸腺嘧啶都能夠整合入處于S期的細(xì)胞，進(jìn)而標(biāo)記前體細(xì)胞與增殖細(xì)胞。BrdU較3H-胸腺嘧啶標(biāo)記法的優(yōu)越性在于其非放射性標(biāo)記的性質(zhì)，可以用免疫組化法觀測(cè)結(jié)果[5]。

Noggin基因最早分離自非洲爪蟾的胚胎，是調(diào)控成體神經(jīng)干細(xì)胞分化的一種胚胎蛋白。參與機(jī)體胚胎組織發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)成熟、關(guān)節(jié)軟骨形成及毛發(fā)生長(zhǎng)等過(guò)程，在缺血腦組織可通過(guò)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)誘導(dǎo)作用[6]。研究表明，BMPs信號(hào)可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞從而抑制神經(jīng)元生成，Noggin基因表達(dá)產(chǎn)物與BMP2/BMP4具有高親和性，阻滯BMP2/BMP4與相應(yīng)受體的結(jié)合，封閉BMPs信號(hào)因而可抑制神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)生[7,8]。Noggin可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，還可提供神經(jīng)元發(fā)生的有利環(huán)境，為神經(jīng)元的生長(zhǎng)提供支持。維持神經(jīng)干細(xì)胞生成與分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間的平衡，調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程[9]。Noggin基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多重功效，被認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療領(lǐng)域具有研究?jī)r(jià)值及應(yīng)用前景。在缺血區(qū)移植Noggin基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞能夠促進(jìn)缺血損傷區(qū)微管結(jié)合蛋白及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)植入的神經(jīng)干細(xì)胞功效。研究顯示，Noggin蛋白可作用于海馬齒狀回顆粒下層及側(cè)腦室下區(qū)，調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞向特定神經(jīng)元分化，用反義寡核苷酸封閉內(nèi)源性Noggin基因可顯著減少上述區(qū)域BrdU陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量[10]。此項(xiàng)研究中，Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組評(píng)分第14 d、21 d顯著低于對(duì)照組及神經(jīng)干細(xì)胞移植組，表明向大腦中動(dòng)脈梗塞大鼠腦組織移植攜帶Noggin基因的神經(jīng)干細(xì)胞較之于單純的神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)神經(jīng)功能損傷的修復(fù)具作用更顯著。Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組移植細(xì)胞分布范圍較廣泛，并向缺血區(qū)域周邊組織遷移，提示Noggin基因可有效促進(jìn)移植細(xì)胞的增殖、遷移與分化。Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植在局灶性腦缺血治療中具有較高臨床意義，為進(jìn)一步開(kāi)展神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合基因治療的研究提供了參考和方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]王淑榮,王晨光,齊首楠,等.大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(2):2190.

[2]Fu WC,Jiang Y,Zhang L,et al.Effect of RSCs combined with COP-1 on optic nerve damadge in glaucoma rat[J]. Asian PacificJournal of Tropical Medicine,2014,10(4):317.

[3]楊巍,王曉明.SD胎鼠腦內(nèi)WWOX表達(dá)與神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)性初探[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(6):798.

[4]Muramatsu SI,Ozawa K,Nakano I,et al.Inducing agent tamoxifen of CreERT2 to reduce the side effects of gene therapy for Parkinson’s disease[J].Neural Regeneration Research，2010,10(2):98.

[5]Zhu WZ,Li X,Qi JP,et al.Experimental Study of Cell Migration and Functional Differentiation of Transplanted Neural Stem Cells Co-labeled with Superparamagnetic Iron Oxide and Brdu in an Ischemic Rat Model[J].Biomedical and Environmental Sciences,2008,21(5):420.

[6]Liu F,Zhong H,Liang JY,et al.Effect of high glucose levels on the calcification of vascular smooth muscle cells by inducing osteoblastic differentiation and intracellular calcium deposition via BMP-2/Cbfα-1 pathway[J].Journal of Zhejiang University-Science B,2010 11(12):905.

[7]張明磊,常非,高忠禮,等.BMP-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及表達(dá)的檢測(cè)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(11):1742.

[8]Sun YR,Zhou LF,Wu X,et al.Prolonged propagation of rat neural stem cells relies on inhibiting autocrine/paracrine bone morphogenetic protein and platelet derived growth factor signals[J].Neural Regeneration Research,2011,10(13):124.

[9]Zhou SN,Li CS,Wei XS,et al.Construction of neuron specific vector of human antisense noggin gene expression[J].Neural Regeneration Research，2010,6(15):673.

[10]Zhang B,Wang RZ,Lian ZG,et al.Neurogenesis by Activation of Inherent Neural Stem Cells in the Rat Hippocampus after Cerebral Infarction[J].Chinese Medical Sciences Journal,2009,24(1):41.

摘要：目的探討Noggin基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植到大鼠局灶性腦缺血處的遷移、分化及對(duì)神經(jīng)功能損傷的修復(fù)作用。方法選取SD大鼠50只建立大腦中動(dòng)脈梗塞模型，隨機(jī)分為對(duì)照組10只，神經(jīng)干細(xì)胞移植組、Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組各20只，分別移植入10 μl PBS、BrdU標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞及Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞。移植前及移植后7 d、14 d、21 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行NSS評(píng)分。25 d時(shí)處死各組大鼠，腦組織免疫組化染色觀察植入細(xì)胞的存活及分布情況。結(jié)果移植后各組NSS評(píng)分均下降，Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組評(píng)分第14 d、21 d顯著低于對(duì)照組及神經(jīng)干細(xì)胞移植組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Noggin-神經(jīng)干細(xì)胞移植組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(126.8±5.46)個(gè)/HP，多于神經(jīng)干細(xì)胞移植組(85.5±4.7)個(gè)/HP，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Noggin基因能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞在缺血區(qū)域的增殖、遷移與分化，對(duì)神經(jīng)功能損傷的修復(fù)具有積極作用。

關(guān)鍵詞：Noggin基因；神經(jīng)干細(xì)胞； 移植； 腦缺血

Observation of neural stem cells modified by Noggin transplantation for the treatment of focal cerebral ischemia effectWUCheng-ji，JINXue-fei，WANGXuan，etal.(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of transplanting Noggin gene modified neural stem cell migration into rats with focalcerebral ischemia.MethodsEstablished middle cerebral artery occlusion model of 50 rats.Randomly divided them into control group of 10,neural stem cells transplantation group,Noggin- neural stem transplantation cell group with 20 in each group.Transplanted into 10 μL PBS,BrdU labeled neural stem cells and neural stem cells of Noggin. Before and on the 7,21,14 d after the transplantation,record NSS score of the rats. rats were killed on the 25 d,and observe the survival and distribution of transplanted cells.ResultsNSS score were decreased fter transplantation.The 14 d,21 d scores were significantly lower than control group and neural stem cell transplantation group.Noggin- neural stem cell transplantation group had BrdU positive cell (126.8±5.46)/HP,more than neural stem cells transplantation group (85.5±4.7)/HP,all with significant difference (P<0.05). ConclusionNoggin gene can promote the proliferation,migration and differentiation of neural stem cells in the ischemic region,having a positive effect on neurological functional recovery.

Key words:Noggin;neural stem cells;transplantation;cerebral ischemia

收稿日期：(2014-05-17)

作者簡(jiǎn)介：吳成吉(1977-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管病的發(fā)病機(jī)制及其治療與預(yù)防。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R743.31

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0540-03 1007-4287(2015)04-0543-04

通訊作者*

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(D2007-02)