表沒食子兒茶素沒食子酸酯聯合視黃酸對宮頸腺癌細胞的抗增殖作用研究

李　杰

(萊蕪市婦幼保健院 婦科,山東 萊蕪271100)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯聯合視黃酸對宮頸腺癌細胞的抗增殖作用研究

李杰

(萊蕪市婦幼保健院 婦科,山東 萊蕪271100)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0547)

流行病學調查表明，茶及其組分對人體的健康具有潛在益處。綠茶含有特殊的茶多酚物質，茶多酚作為綠茶中主要的有效活性成分占綠茶干重的30%-42%。其中兒茶素是生物活性最高的成分。兒茶素是以兒茶和沒食子酸基團結合形成的一類活性物質，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是兒茶素中含量最高也是活性最高的成分[1]。報道資料顯示，EGCG主要有抑菌作用、抗炎作用、抗氧化作用和抗心血管疾病作用等藥理作用，同時EGCG能明顯抑制許多類型癌細胞的生長，因此，EGCG的抗癌潛能已成為國內外研究的熱點之一[2]。

視黃酸(retinoic acid,RA)是一組自然或人工合成的維生素A類似物，在調節生長、分化和形態發生等方面起重要作用。大量的體外研究證實，RA能逆轉癌前病變、抑制繼發瘤形成以及抑制癌細胞生長[3]。因此，基于已知研究基礎和理論，本研究探討EGCG 聯合RA對HPV18呈陽性表達的宮頸腺癌HeLa細胞增殖的影響，以期為EGCG和RA的應用提供基礎資料。

1材料與方法

1.1　主要材料

胎牛血清和高糖DMEM培養基購自Gibco公司；胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素、硫酸鏈霉素、EGCG、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)和四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自美國Sigma公司；宮頸腺癌HeLa細胞購自美國模式菌種收集中心(American type culture collection,ATCC)，實驗常規凍存。

1.2　方法

1.2.1細胞培養HeLa細胞培養于含10%滅活胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 U/mL硫酸鏈霉素的高糖DMEM(D-10培養基)細胞培養液中，置于37℃，5% CO2細胞培養箱，2-3天換液。細胞傳代時，棄去培養基，預熱PBS洗兩次，0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞變圓時棄去胰蛋白酶，加入含10%滅活胎牛血清的培養液輕輕吹散細胞團，然后分裝入細胞培養瓶中并加入適量培養液繼續培養，待培養瓶內細胞生長至80%后用于后續實驗。

1.2.2細胞增殖抑制檢測將1×105的HeLa細胞接種于96孔細胞培養板中培養24 h，實驗組(添加終濃度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同時含有終濃度0.1 μmol/L的RA)，同時設對照組，每組重復3孔。分別于2、4、8、16、32 h后，加MTT液(5 mg/mL)20 μL /孔，繼續培養4 h，吸棄上清液，加入150 μL /孔DMSO振蕩混勻10 min，使藍紫色沉淀充分溶解，選擇490 nm波長，在全自動酶標儀上測定吸光度A值，實驗重復3次。按下列公式計算平均細胞生長抑制率：細胞生長抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.3細胞毒性檢測將1×105的HeLa細胞接種于96孔板中培養24 h，實驗組(添加終濃度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同時含有終濃度0.1 μmol/L的RA)，同時設對照組，每組重復3孔。37℃，5% CO2培養箱培養12 h。將96孔培養板1 000 rpm 離心5 min，分別從各孔中取120 μL的上清液加入到新的96孔培養板中。分別向每個孔中加入60 μL含20 μL乳酸溶液，20 μL 1×INT溶液和20 μL酶溶液的LDH檢測工作液，混勻后包上鋁箔，室溫置于搖床上輕輕震蕩孵育30 min。選擇490 nm波長，在全自動酶標儀上測定吸光度A值。

1.2.4細胞凋亡和細胞周期分析將1×105的HeLa細胞接種于96孔板中培養24 h，實驗組(添加終濃度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同時含有終濃度0.1 μmol/L的RA)，同時設對照組，每組重復3孔。37℃，5% CO2培養箱培養12 h。顯微鏡下觀察細胞形態變化。收集細胞并加入70%乙醇溶液固定，置于-20℃過夜，PBS(pH 7.0)洗2次，2 000 rpm離心5 min，棄去上清。加入100 μL碘化丙錠染色液室溫染色30 min，PBS(pH 7.0)洗2次，2000 rpm離心5 min，棄去上清。加入100 μL PBS(pH 7.0)懸浮細胞，經流式細胞儀檢測細胞凋亡比率和細胞周期。

1.3　統計學分析

2結果

2.1　細胞增殖抑制作用

不同濃度和不同時間點的EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞的增殖的影響作用見表1。結果顯示，與單獨EGCG相比，各種劑量組EGCG聯合RA在4h和8h時對HeLa細胞的增殖具有顯著抑制作用。同時，無論是單獨EGCG組還是EGCG聯合RA組的抑制作用具有時間依賴性，除5mg/L劑量組外，其他各劑量組隨作用時間的延長，抑制作用增強，而作用8h以后出現下降趨勢，但并沒有顯著差異(圖1)。EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞增殖的抑制作用具有明顯濃度依賴性，從5μmol/L起對HeLa細胞增殖的抑制效應逐漸增加(圖2)。此外，利用SPSS19.0軟件分析濃度-抑制率相關性，求得的抑制率應用SPSS軟件作直線回歸分析，將抑制率=50代入方程求出EGCG組在2、3、8、16、32h時的半數抑制濃度IC50分別為38.02、31.29、31.84、32.20、33.39μmol/L，而EGCG聯合RA組在這些時間點的IC50明顯低于單獨EGCG組，分別為37.90、27.20、27.24、30.65、31.37μmol/L(表2)。

表1　不同劑量EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞增殖的抑制作用(%)

注：與EGCG比較，*P<0.05為差異顯著；**P<0.01為差異極顯著。下同

A：EGCG； B：EGCG+RA

A：EGCG；B：EGCG+RA

EGCG(μmol/L)510204080EGCG38.0231.2931.8432.2033.39EGCG+RA37.9027.2027.2430.6531.37

2.2　細胞毒性

通過檢測細胞培養液上清中LDH的活力判斷其釋放率，以評價EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞的毒性作用。無論是單獨EGCG組還是EGCG聯合RA組對HeLa細胞的毒性作用具有濃度依賴性，除5 mg/L劑量組外，其他各劑量組隨作用時間的延長毒性作用增強。同時這種作用還具有時間依賴性，作用時間為24 h時，細胞毒性作用強于12 h。而對于培養液中加入RA后，無論是作用12 h還是作用24 h的細胞毒性作用均有一定程度增強(圖3)。

2.3　細胞凋亡

通過顯微鏡觀察不同劑量EGCG和EGCG聯合RA誘導HeLa細胞死亡的形態學特征。空白對照組連接緊密、飽滿透亮，與空白對照組相比，所有藥物組干預HeLa細胞12 h后，可以觀察到HeLa細胞的細胞形態發生了典型的細胞凋亡變化，如細胞失去正常形態、變圓，折光性減少，細胞表明無光澤、變粗糙，同時細胞發泡，出現核濃縮和核破裂現象。培養液中加入RA后，這些現象有所增強，并且上清液中有較多的細胞碎片。

與空白對照組相比，無論是單獨EGCG組還是EGCG聯合RA組誘導HeLa細胞的凋亡率明顯升高，并且隨著濃度增加呈不斷增強趨勢，但40 μmol/L和80 μmol/L無明顯差異。與單獨EGCG組相比，EGCG聯合RA低濃度組對HeLa細胞凋亡率無明顯影響，但20、40、80 μmol/L組誘導HeLa細胞凋亡明顯增加(表3)。

表3　EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞凋亡的影響(%)

圖3　EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞的毒性作用

2.4　細胞周期分析

各劑量EGCG和EGCG聯合RA處理HeLa細胞12 h后，對照組和不同濃度實驗組細胞周期分布見表4。無論是單獨EGCG組還是EGCG聯合RA組不同劑量處理HeLa細胞后細胞周期均被阻斷在G0/G1期，S期所占比率明顯下降，并且隨著濃度增加呈不斷增強趨勢。培養液中加入RA后，僅高濃度組(20、40、80 μmol/L)與單獨EGCG組相比作用明顯增強。

表4　EGCG和EGCG聯合RA對HeLa細胞周期的影響(%)

3討論

綠茶中含有多種茶多酚活性成分物質，主要有8種單體：EGCG、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素(C)。茶多酚具有降脂、降血糖、抗氧化等藥理學作用，此外，研究資料顯示，包括皮膚癌、肺癌、口腔癌、食管癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等在內的體外細胞和體內動物模型實驗證明了茶多酚具有抑制腫瘤的作用[4]。其中，EGCG含量最高，占茶多酚制品的40%-50%，同時也是綠茶中抗腫瘤活性最強的成分，EGCG可從誘導凋亡、周期阻滯、信號傳導等多種途徑發揮抗癌作用，目前發現EGCG對前列腺癌、肺癌、白血病、鼻咽癌、大腸癌、宮頸癌等腫瘤細胞均有抑制作用，因此，EGCG已經被列為一種抗癌新藥在許多國家進行研究，顯示出了很好的應用前景。

宮頸癌是全球范圍威脅女性健康的的三大惡性腫瘤之一[5]。它的發展分為不同的階段，逐漸出現嚴重腫瘤發展前期的異性增生，即宮頸上皮成瘤的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期。雖然宮頸腺癌較鱗癌少見，但近年來，宮頸腺癌的發病率及其在宮頸癌中所占比例不斷上升，且發病趨于年輕化，預后比同期鱗癌差。同時，宮頸腺癌更具有侵染的生物活性，卵巢轉移率高于鱗癌，同時愈后不良、淋巴結轉移以及對放射電離和化學治療不敏感等。臨床治療方面除了常規的手術、放化療之外，并無太多有效的治療策略[6]。許多體內和體外研究表明，日常飲食中攝入多酚類物質不僅具有抗氧化作用，而且還能預防腫瘤。體外研究顯示，EGCG對宮頸腺癌細胞TMCC-1這種細胞系的生長具有抑制作用，有效的IC50為100 μM，同時具有誘導這種細胞凋亡的作用。本研究結果表明，EGCG對HeLa細胞的增殖具有抑制作用，且這種作用具有時間和濃度依賴性，在2、3、8、16、32 h時的IC50分別為38.02、31.29、31.84、32.20、33.39 μmol/L。EGCG不同劑量處理HeLa細胞后細胞周期均被阻斷在G0/G1期，可誘導HeLa細胞凋亡，高濃度時凋亡率達到42.35%。

維生素A在調節細胞生長和分化中起著重要作用，因此一直認為維生素A在預防和治療腫瘤方面有著潛在的作用。維生素A具有生物活性的分子形式是視黃醇、視黃醛和RA，其中RA又稱維生素甲酸、維甲酸、異維A酸等，是動物體內維生素A的代謝中間產物。RA最早用于尋常性痤瘡、扁平苔癬(包括口腔扁平苔癬)、白斑、毛發紅糠疹、面部單純糠疹和牛皮癬等皮膚病。而自20世紀80年代中期我國學者首先利用全反式維甲酸通過誘導細胞分化有效治療急性早幼粒細胞白血病以來，視黃酸抗腫瘤的研究一直受到各國學者的高度重視。雖然RA抗腫瘤的機理至今仍未闡明，但研究顯示，RA對成神經細胞腫瘤、胃癌、卵巢癌、宮頸癌等的增殖具有抑制作用、可誘導腫瘤細胞分化和凋亡、增加癌細胞對化療藥物的敏感性、促進免疫細胞的增殖以及增強免疫細胞對腫瘤細胞殺滅作用[7]。雖然RA對腫瘤細胞有良好的治療效果，但是其毒性太大，水溶性差以及給藥靶向性差等缺點，限制了其在臨床上的進一步應用，因此更多的臨床應用研究是聯合其他抗腫瘤藥物。本文結果也顯示，RA能夠顯著增強EGCG對HeLa細胞增殖的抑制作用，在2、3、8、16、32 h時的IC50分別為37.90、27.20、27.24、30.65、31.37 μmol/L。并且RA能夠顯著增強EGCG阻斷HeLa細胞的細胞周期在G0/G1期，可誘導HeLa細胞凋亡，40 μmol/L和80 μmol/L誘導HeLa細胞的凋亡率分別達到45.18%和45.89%。

因此，RA能夠顯著增強EGCG抑制宮頸腺癌HeLa細胞的增殖，提示二者聯合用藥可通過抑制細胞周期進程和促進細胞凋亡來發揮其HeLa細胞的協同抑制作用，為其臨床應用提供了新的策略。

參考文獻：

[1]表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)抗腫瘤研究進展[J].中國腫瘤，2006，15(7)：453.

[2]滕翠琴，龔受基，劉仲華.綠茶成分EGCG 抗腫瘤作用研究進展[J].茶葉通訊，2012，39(4)：8.

[3]史得發，唐建斌，隋梅花，等.維A酸衍生物抗癌藥物的研究進展[J].中國藥學雜志，2013，48(5)：321.

[4]杜玉，婁紅祥.表沒食子兒茶素沒食子酸酯藥理作用研究進展[J].國外醫藥·植物藥分冊，2006，21(6)：244.

[5]李寧，吳令英.宮頸腺癌的治療進展[J].癌癥進展雜志，2009，7(2)：122.

[6]李清，馮煒煒.宮頸腺癌的研究進展[J].國際婦產科學雜志，2012，39(4)：330.

[7]Duwster G.Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis [J].Cell,2008,134(6):921.

摘要：目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)聯合視黃酸(retinoic acid, RA)對宮頸腺癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響。方法將1×105的HeLa細胞接種于96孔培養板，分實驗組(添加終濃度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同時含有終濃度0.1 μmol/L的RA)和空白對照組。MTT法檢測EGCG或聯合RA對HeLa細胞增殖的影響。LDH檢測試劑盒檢測EGCG或聯合RA對HeLa細胞的毒性。流式細胞儀分析EGCG或聯合RA對HeLa細胞周期和凋亡的影響。結果與單獨EGCG相比，各種劑量組EGCG聯合RA對HeLa細胞的增殖具有顯著抑制作用，這種作用具有時間和濃度依賴性。EGCG聯合RA組(37.90、27.20、27.24、30.65、31.37 μmol /L)在2、3、8、16、32 h時的半數抑制濃度IC50明顯低于EGCG組(38.02、31.29、31.84、32.20、33.39 μmol /L)。同時，無論是單獨EGCG組還是EGCG聯合RA組對HeLa細胞的毒性作用也具有時間和濃度依賴性，而相對于單獨用藥，聯合RA無論是作用12 h還是作用24 h的細胞毒性作用均有一定程度增強。此外，流式細胞儀檢測結果顯示，無論是單獨EGCG組還是EGCG聯合RA組不同劑量處理HeLa細胞后凋亡率明顯升高且細胞周期均被阻斷在G0/G1期，S期所占比率明顯下降，而聯合組較單獨組呈增強趨勢。結論RA能夠增強EGCG抑制宮頸腺癌HeLa細胞增殖并誘導其凋亡，且使其周期阻斷于G0/G1期。

關鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯；視黃酸；宮頸腺癌；增殖

The study of antiproliferative effect of EGCG combined with RA on cell of cervical adenocarcinoma.LIJie.(LaiwuMaternalandChildCareServiceCentre,Laiwu271100,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of epigallocatechin gallate (EGCG) combined with retinoic acid (RA) on the proliferation and apoptosis of Hela cell of cervical carcinoma.Methods1×105Hela cells were inoculated in 96-well culture plates, the cells were divided into experimental group (including EGCG with final concentration of 5 μmol /L, 10 μmol/L, 20 μmol /L, 40 μmol /L and 80 μmol/L, or at the same time including RA with final concentration of 0.1 μmol/L) and control group. The method of MTT was used to test the effect of EGCG of combined with RA on proliferation of Hela cells, and the method of LDH was used to test the toxic effects of EGCG or combined with RA on Hela cells, flow cytometry (FCM) was used to analyzed the effect of EGCG of combined with RA on the cycle and apoptosis of Hela cells.ResultsEvery-dosage group of EGCG combined with RA had the remarkable inhibiting effects on the proliferation of Hela cells in concentration-and time-dependent manners comparing to the alone EGCG group. Inh ibitory concentration (IC50) of EGCG combined with RA group (37.90、27.20、27.24、30.65、31.37 μmol/L)significantly lower than the alone EGCG group (38.02、31.29、31.84、32.20、33.39 μmol/L) in 2、3、8、16、32 h respectively. And the toxic effects of alone EGCG group and EGCG combined with RA both depended on the time of effects and concentration of EGCG of RA. Comparing to alone EGCG, the toxic effects of EGCG combined with RA on Hela cells strengthen to a certain extent on 12h and 24h respectively. The results of FCM indicated the effects of different doses of EGCG on Hela cells can remarkably increase the apoptosis rate of cell and the cell circle was blocked on G0/1 period no matter alone EGCG or EGCG combined with RA groups, but the rate of S period declined obviously, and the the EGCG combined RA group had the enhance trend comparing to alone EGCG group.ConclusionRA can increase the inhibiting effect of EGCG on proliferation of Hela cell of cervical carcinoma, and reduce it's apoptosis and block the cell on G0/G1 period.

Key words:Epigallocatechin gallate; Retinoic acid; Cervical adenocarcinoma; Proliferation

收稿日期：(2013-11-26)

作者簡介：李杰(1973-)，女，大學本科，主治醫師，長期從事婦科的臨床和研究工作。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R737.33

文章編號：1007-4287(2015)04-0547-05