新生兒干血斑β地中海貧血篩查方法的研究

黃爍丹,張惠琴,鄒　婕,莊宇嫦,熊　蓉,吳　維,徐　怡,肖硯微,鄒秀齊

(1.梅州市婦幼保健院，廣東 梅州514021；2.梅州市人民醫院，廣東 梅州514021)

新生兒干血斑β地中海貧血篩查方法的研究

黃爍丹1,張惠琴2,鄒婕1,莊宇嫦1,熊蓉1,吳維1,徐怡1,肖硯微1,鄒秀齊1

(1.梅州市婦幼保健院，廣東 梅州514021；2.梅州市人民醫院，廣東 梅州514021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0582)

地中海貧血(簡稱“地貧”)又稱珠蛋白生成障礙性貧血，是我國華南地區高發的遺傳性溶血性疾病，亦是南方地區重點防治的單基因遺傳病[1-3]，由β珠蛋白基因異常導致β珠蛋白肽鏈合成缺乏稱為β地貧。采取現代化先進技術，通過有效模式對新生兒進行β地貧早期篩查和干預，意義重大。目前，國內未見大規模新生兒β地貧篩查的報道，缺乏較成熟的篩查方法和工作模式，本研究應用新生兒疾病篩查的濾紙干血斑標本，采用全自動毛細管血紅蛋白電泳技術，建立了一套用于新生兒β地貧篩查的綜合分析法，現將研究結果報道如下。

1樣本與方法

1.1　樣本

1.1.1樣本采集 2012年1月至2013年12月，按照新生兒疾病篩查標本采集技術規范，對145904例在梅州市各醫療保健機構出生的新生兒，于出生后3-7天，在知情同意的情況下采集足跟血血斑標本，遞送至本機構進行電泳篩查，并對篩查陽性者召回進行基因診斷。

1.1.2標本分組從2012年1月至2013年3月采集的95059例標本用“HbA界值法” 篩查β地貧；從2013年4月-12月采集的50845例標本用 “綜合分析法”篩查β地貧；2013年4月采集的標本中隨機抽取600例標本同時用 “HbA界值法”和“綜合分析法”篩查β地貧，血斑標本同時進行地貧基因檢測。

1.2　儀器與試劑

1.2.1血紅蛋白分析采用法國Sebia公司的Capillarys 2全自動毛細管電泳儀及配套血紅蛋白電泳試劑盒。

1.2.2基因檢測基因擴增儀、分子雜交儀及β地貧基因診斷試劑盒 (廣東凱普生物技術有限公司提供)。

1.3　新生兒干血斑血紅蛋白電泳

1.3.1血紅蛋白電泳從濾紙干血斑打下一個4.84 mm2血斑片，置于50 μL 蒸餾水的測試杯中溶解，保濕過夜，第二天將準備好的測試杯直接放入Sebia Capillarys 2全自動毛細管電泳儀中檢測，按照儀器的操作規程完成標本檢測。

1.3.2根據Sebia Capillarys 2全自動毛細管電泳儀報告的結果分別統計每個標本的HbA、HbA2的含量。

1.4　β地貧篩查陽性的判讀

1.4.1HbA界值法根據血紅蛋白組分HbA的含量判斷β地貧篩查陽性，電泳結果如HbA≤9.5%(切值為廠家提供)或出現HbE則判斷為β地貧篩查陽性，如HbA < 2.5%，則疑為重型β地貧。

1.4.2綜合分析法根據血紅蛋白組分HbA含量、HbA2含量及HbA2/HbA比值篩查β地貧陽性，具體方案如表1所示。

表1　綜合分析法β地貧篩查陽性判斷表

*注：篩查時若出現HbE，直接判斷為篩查陽性。

1.5　基因檢測

采用聚合酶鏈反應-反向點雜交(PCR-RDB)技術進行南方地區常見的16種β珠蛋白基因點突變分析，檢測的突變位點包括41-42、IVS-II-654、-28、71-72、17、βE、31、IVS1-1、27/28、43、-29、-30、14-15、CAP、Int和IVS1-5。

1.6　統計分析

數據采用MedCalc 12.3.0軟件包進行處理。以基因診斷結果為β地貧診斷標準，分別統計分析HbA界值法和綜合分析法的診斷敏感度、特異度、準確性及假陽性率，卡方檢驗(χ2)比較兩者的診斷價值，以P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1新生兒干血斑血紅蛋白毛細管電泳結果

如圖1所示，新生兒干血斑毛細管電泳可精確分離并檢測Hb Bart’s、HbA、HbF和HbA2等血紅蛋白組分。用配套軟件將HbA2區放大后進行判讀，可靈敏檢測到含量<0.1%的HbA2。

2.2篩查結果陽性的血紅蛋白電泳圖譜圖2和圖3分別顯示利用HbA界值法和綜合分析法篩查結果為陽性的血紅蛋白電泳圖，圖示中的標本均經過基因檢測確診為β地貧。

2.3HbA界值法篩查陽性的基因確診符合率

采用HbA界值法篩查的95059例標本中陽性3941例，篩查陽性率4.1%，召回篩查陽性者1580例進行了地貧基因檢測，確診為β地貧716例，符合率45.32%，假陽性率54.68%。其中召回的13例HbE全部確診為輕型β地貧(βE雜合子)，符合率為100%；召回的37例篩查疑為中重型β地貧者有35例確診為β地貧純合子或雙重雜合子(2例為雜合子)，中重型β地貧符合率為94.6%，β地貧符合率為100%。結果見表2。

圖1毛細管電泳可準確的檢測新生兒干血斑標本中的

Hb Bart`s、HbA 、HbF、HbA2

圖2　HbA界值法篩查陽性圖　 A、B為兩個不同的陽性篩查結果，A疑為重型β地貧。

圖3　綜合分析法篩查陽性圖

表2　HbA界值法篩查陽性召回基因確診結果統計表

2.4綜合分析法篩查陽性的基因確診符合率

采用綜合分析法篩查的50845例標本中陽性2032例，篩查陽性率4.0%，召回篩查陽性者1266例進行基因檢測，確診為β地貧930例，符合率73.46%，假陽性率26.54%。15例篩查疑為中重型β地貧者有14例確診為β地貧純合子或雙重雜合子(1例為輕型)，中重型β地貧符合率93.3%，β地貧為100%。結果見表3。

表3　綜合分析法篩查陽性召回基因確診結果統計表

2.5HbA界值法和綜合分析法的對比研究

從2.3和2.4的結果中，我們發現兩種方法的篩查陽性率無明顯差異，但綜合分析法篩查陽性與基因檢測結果的符合率明顯高于HbA界值法，但由于上述的結論是針對不同的標本，因此我們采用HbA界值法和綜合分析法分別對600例標本同時進行篩查和基因檢測，其中β地貧22例，陰性578例，HbA界值法與綜合分析法的篩查結果如表4所示。表5顯示了兩種方法的篩查能力比較。結果表明，綜合分析法敏感度、陽性預測值和篩查的準確性顯著高于HbA界值法(P均<0.05)，綜合分析法的的特異性和陰性預測值略高于HbA界值法(0.01>P>0.05)。

表4　HbA界值法與綜合分析法對600例標本的篩查結果

表5　HbA界值法與綜合分析法診斷能力比較

3討論

正常新生兒的HbF約占70%，HbA 約占30%，HbA2少于1%[4]。地貧患兒的各種Hb組分和含量會發生變化，通過分離技術分析各種血紅蛋白的成分和含量，從而判斷是否為地貧。新生兒干血斑標本被廣泛應用于多項新生兒出生疾病的篩查，不僅取血方便，且標本易于運輸，非常適用于新生兒疾病的常規篩查。目前新生兒地貧篩查多采用臍帶血，標本不易保存和運輸，限制了新生兒地貧篩查的廣泛應用。用于分析新生兒干血斑標本的全自動毛細管血紅蛋白電泳分析技術[5]的出現為解決這一難題提供了可能。全自動毛細管血紅蛋白電泳分析技術，利用新生兒濾紙干血斑中的微量血紅蛋白，在高壓電的作用下，在直徑為25微米的毛細管中實現不同血紅蛋白組分的分離。該技術對各種血紅蛋白組分檢測敏感、穩定，可準確地檢測并定量各種血紅蛋白組分，如Hb Bart’s、HbA、Hb F和HbA2等[5-8]，是目前新生兒地貧篩查最簡便、有效的技術平臺[9]。目前國內尚未見此項技術進行β地貧篩查的研究報道。

正常胎兒從3個月開始合成HbA，至6個月時增加到5%-10%，分娩時可達到35%-40%。β地貧患兒由于β珠蛋白合身障礙，其HbA含量低于正常新生兒，且HbA水平越低提示β地貧越嚴重，因此，臨床常利用HbA含量篩查β地貧[10]。

根據國內外新生兒地貧篩查研究[8-12]，結合作者實驗室的臨床經驗和廠家提供的切值，把HbA<9.5%作為HbA界值法篩查β地貧的初步方案，篩查的陽性率為4.1%，略高于黃爍丹報導的分子流行病學調查結果3.4%[13]。其中，把HbA<2.5%作為重型β地貧的篩查閾值，研究發現，其篩查的重型β地貧新生兒基因確診符合率是98.1%，證明HbA<2.5%是新生兒重型β地貧的有效篩查指標。對HbA界值法篩查出的全部陽性標本進行基因確診試驗表明，確診符合率為45.32%，假陽性率54.68%。此結果明顯低于陳和平[11]、甘冰[12]等利用瓊脂糖電泳檢測臍帶血HbA含量篩查β地貧的確診符合率(分別為84.3%和78.4%)。這可能與本研究采用的是新生兒干血斑毛細管電泳法，而他們用的是臍帶血瓊脂糖電泳法有關，另一方面，干血斑標本是在出生后3-7天采集，臍血是出生時即采，標本采集時機不同可能也有關系。HbA界值法由于假陽性率偏高，造成過多的不必要召回和復診，給受檢者造成不必要的經濟和精神負擔，分析方法急需改良。

研究中我們發現，HbA界值法篩查陽性標本的HbA含量主要分布在7.4%-9.5%區間，占總篩查陽性數的67.12%，但其確診符合率僅為34.18%，假陽性率高達65.82%。可見，該區間是造成HbA界值法篩查假陽性率高的主要原因，本研究針對這一部分進行了改良，建立了綜合分析法。

綜合分析法是在HbA界值法的基礎上，結合HbA2的含量、HbA2/HbA比值和HbE建立起來用于新生兒β地貧篩查的毛細管血紅蛋白電泳結果分析方法。由于δ珠蛋白的合成開始于妊娠后期，新生兒血液中可出現微量的Hb A2(α2δ2)[8]，β地貧新生兒出現代償性的δ肽鏈合成增加或提前出現，使HbA2比例升高或者提前出現。本研究發現采用的全自動毛細管血紅蛋白電泳分析技術檢測新生兒干血斑標本，可敏感檢測出微量HbA2，為綜合分析法的建立提供了條件。研究中我們發現，當HbA<7.4%時，HbA2與β地貧無相關性，故綜合分析法未把HbA2/HbA比值做為判斷指標，此部分陽性者的確診符合率與HbA界值法接近(63.27% vers 64.67%)；而針對HbA在7.4%-9.5%區間的陽性者，綜合分析法引入HbA2/HbA比值作為篩查指標之一，確診符合率明顯提高(66.41% verse 34.18%)，顯著降低了此區間的假陽性率。針對HbA界值法無法篩查的HbA >9.5%的新生兒標本，綜合分析法創新性的結合HbA2/HbA比值，其篩查出的陽性標本確診符合率高達82.1%，這部分屬于HbA界值法無法篩查到的漏篩病例。經上述初步試驗結果表明，綜合分析法總的確診符合率提高到73.46%，假陽性率降低至26.54%，明顯優于HbA界值法。

鑒于綜合分析法的初步評估試驗與HbA界值法的評估試驗來源于不同的標本，為進一步明確兩種血紅蛋白電泳分析方法篩查β地貧的優劣，我們利用HbA界值法和綜合分析法分別對600例樣本同時進行篩查，并全部進行基因檢測。結果表明，綜合分析法的敏感度、陽性預測值和篩查準確性顯著高于HbA界值法(P均<0.05)，特異性和陰性預測值也是綜合分析法高于HbA界值法。

綜上所述，新生兒干血斑的全自動毛細管血紅蛋白電泳技術簡便、易用，包括HbA、HbA2和HbA2/HbA比值的綜合分析法可顯著提高篩查β地貧的敏感度和準確性。綜合分析法值得通過目前已較完善的新生兒疾病篩查網絡大力推廣，以實現大規模的地貧篩查和防控。

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[13]黃爍丹，張惠琴，等.廣東省梅州地區地中海貧血的分子流行病學調查[J].熱帶醫學雜志，2011，11(7)：788.

摘要：目的探討全自動毛細管微量血紅蛋白電泳技術在新生兒β地中海貧血篩查中的應用價值，并尋求有效的篩查方法。方法使用Sebia全自動毛細管電泳儀對145904例新生兒濾紙干血斑標本進行血紅蛋白(Hb)電泳；對95059例標本的電泳分析結果以HbA界值法判讀β地貧篩查結果，對50845例標本的電泳分析結果以HbA值結合HbA2/HbA比值的綜合分析法判讀β地貧篩查結果，召回篩查陽性者進行地貧基因診斷；隨機對600份標本的電泳結果同時以上述兩種方法判讀β地貧篩查結果，同時進行基因檢測作為β地貧診斷的金標準，統計比較兩種判讀方法的差異。結果HbA界值法篩查出的1580例陽性標本中經基因檢測確診為β地貧的有716例，確診符合率45.32%，假陽性率為54.68%；綜合分析法篩查出的1266例陽性標本中930例經基因檢測確診為β地貧，符合率73.46%，假陽性率為26.54%。同時對600例新生兒干血斑分析結果表明，HbA界值法和綜合分析法的敏感度和特異度分別是54.55%、90.91%和97.58%、99.31%，兩者的篩查準確性分別為96%和99%。統計結果表明，綜合分析法的敏感度、陽性預測值和篩查的準確性顯著高于HbA界值法.結論新生兒干血斑標本經毛細管血紅蛋白電泳后，利用包含HbA、HbA2組分的含量及HbA2/HbA比值的綜合分析法判讀電泳結果，篩查新生兒β地貧，靈敏度和準確性顯著提高，假陽性率明顯降低，值得推廣應用。

關鍵詞：β地中海貧血；毛細管電泳；新生兒；干血斑

The study of beta-thalassemia screening methods of Neonate dry blood spot samplesHUANGShuo-dan,ZHANGHui-qin,ZHOUJie,etal.(1.MaternalandChildHealthHospitalinMeizhou,Meizhou514021China)

Abstract:ObjectiveEvaluate the application of capillary hemoglobin electrophoresis in neonate beta-thalassemia screening.MethodsThe Hb electrophoresis of 145904 dry neonatal blood samples was analyzed on Sebia Capillary Neonate Fast.The HbA cut-off value (Method I) was used to screen beta-thalassemia for 95059 dry blood samples and the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio (Method II) was used to screen beta-thalassemia for the remaining 50845 dry blood samples.The subjects with positive results were recalled and confirmed by genotyping test.The 600 dry blood samples were collected randomly and the Hb electrophoresis results were check by both of Method I and Method II.The genotyping test was the reference to analyze the difference of both of the methods.ResultsThe genetic diagnosis results of recalled 1580 positive cases according to the Method I showed that the true positive were 716 cases with true positive rate 45.32% and false positive rete 54.68%.The 930 cases were verified by genetic diagnosis among the recalled 1266 cases according to the Method II with true positive rate 73.46% and false positive rete 26.54%.The results of 600 samples showed that the sensitivity and specificity for beta-thalassemia screening of Method I and Method II were 54.55%、90.91%和97.58%、99.31% respectively.The true positive rates were 96% and 99% for Method I and Method II respectively.The results demonstrated that the Method II is superior to Method I for beta-thalassemia screening.ConclusionAfter the capillary dry blood Hb electrophoresis analysis,the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio method for beta- beta-thalassemia screening is more sensitive and specific and lower false positive rate than HbA cut-off value method and the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio method should be applied to more areas for newborn screening.

Key words:beta-thalassemia; capillary electrophoresis; neonate; dry blood spot

收稿日期：(2014-06-20)

作者簡介：黃爍丹，男，38歲，副主任技師，遺傳中心主任，醫務科副科長,研究方向是新生兒遺傳代謝病篩查和早期干預技術。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R556.6+1

文章編號：1007-4287(2015)04-0582-05

基金項目：廣東省醫學科學基金立項課題(A2012762)