腎穿刺活檢病理PASM染色方法改良探討

腎穿刺活檢病理PASM染色方法改良探討

曲樂1，劉樹軍1，徐進2，高丹1，婁巖1*

(1.吉林大學第二醫院 腎病內科,吉林 長春130041；2.北京大學第一醫院 電鏡室)

目前腎穿刺活檢是腎病內科診斷腎臟疾病的主要方法[1-3]。在腎穿刺活檢病理診斷中，顯示腎小球基底膜病變及免疫復合物定位主要采用PASM (Periodic Acid-SilverMethenamine) 染色法。在臨床實踐中發現，傳統的PASM染色法染色效果不佳，不能顯示免疫復合物沉積的情況，基底膜顯色較重，背景較深，染色時間過長，并且常有雜質粘附于組織表面，影響臨床病理診斷。針對以上問題，本實驗對染液的配制方法、染色條件及切片的厚度進行了調整?？偨Y出配方合理、染色穩定和可重復性強的染色方法。

1材料與方法

1.1標本處理與分組隨機選取吉林大學第二醫院腎病內科腎穿刺活檢組織標本256例，經10%中性福爾馬林溶液固定24 h，組織常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片厚度為1 μm，63℃烤片4.5 h。將標本隨機分為兩組，每組為128例，分別用傳統PASM染色方法和改良PASM染色方法染色，在同一時間，同一環境下進行染色，染色結果由經驗豐富的病理醫師采用雙盲進行評價。

1.2染液配置方法

1.2.1傳統六氨銀溶液配制方法3%六次甲基四胺水溶液25 ml，加入5%硝酸銀水溶液2.5 ml，震蕩至乳白色懸濁液變為清亮透明，加入5%四硼酸鈉5 ml，加入22.5 ml蒸餾水，最后加入4%硼酸7滴，混勻后過濾立即使用，如果不立即使用放入4℃冰箱避光儲存。

1.2.2改良六氨銀溶液配制方法3%六次甲基四胺水溶液25 ml，加入2%四硼酸鈉5 ml，加入5%硝酸銀水溶液2.5 ml，震蕩至乳白色懸濁液變為清亮透明，加入30 ml蒸餾水，最后加入4%硼酸5滴，混勻后過濾立即使用，如果不立即使用放入4℃冰箱避光儲存。

1.2.3Masson染液配制方法3.2 g磷鎢酸、4 ml冰醋酸、2.4 g變色酸2R及1.5 g亮綠，依次逐一加入400 ml的蒸餾水中，混勻后備用。

1.3PASM染色方法1μm組織切片脫蠟至水；1%過碘酸氧化5 min；蒸餾水沖洗2 min；置切片于新鮮配制的六氨銀作液中，于65℃溫箱中加溫20-30 min肉眼見切片呈褐黃色，鏡下見腎小球基底膜呈黑色為止；根據銀染情況選擇性的用0.1%氯化金分化，3%硫代硫酸鈉定影15 s，蒸餾水洗2 min；經蘇木精染核5-6 min，蒸餾水沖洗2 min；1%鹽酸酒精水溶液分化數秒，自來水洗2min；弱氨水返蘭數秒；Masson染液套染數秒，鏡下觀察染色情況適時終止； 高濃度梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4統計學方法采用SPSS16.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組PASM染色制片質量情況評價128例標本經改良PASM染色，其中2例染色過度，3例染色過淺，1例多余銀顆粒雜質沉積，共計6例制片質量不合格，制片質量合格率為95.31%。128例標本經傳統PASM染色，33例染色過度，1例染色過淺，25例含有多余銀顆粒沉積，59例制片質量不合格，制片質量合格率為61.72%，在銀染過度和多余銀顆粒雜質沉積兩項評價指標中，改良PASM染色法制片質量優于傳統PASM染色法，其中銀染過淺評價指標中顯示兩種方法差異無統計學意義，銀染過淺情況發生率極低(見表1)，造成銀染過淺的原因除了時間的因素外，是否與試劑的批號有關需做進一步研究。

表1　兩組PASM染色制片質量情況評價(例數)

2.2腎組織石蠟切片的改良PASM染色方法和傳統PASM染色方法染色效果比較改良PASM染色結果顯示基底膜、網狀纖維、IV型膠原呈黑色，且“勾勒”清晰，免疫復合物呈紅色，細胞核為呈藍色，背景呈粉紅色、清晰無雜質(圖1-A)，而傳統的PASM染色結果常使示基底膜六氨銀染色過深或過淺，易產生細胞增生和基底膜增厚的假象，并且背景易出現銀顆粒雜質(圖1-B、圖1-C)，不能真實反映出腎臟的病理變化，不利于臨床診斷。

A：染色適中；B：染色過深：C：染色過淺且有銀顆粒雜質

3討論

PASM染色的基本原理是腎小球基底膜和系膜區等部位的蛋白多糖被1%過碘酸氧化后暴露出醛基，醛基再與六氨銀染液中銀離子發生銀鏡反應，然后再套以Masson三色染色，染色結果能夠清晰地顯示基底膜、系膜的病變和免疫復合物沉積的情況[4]。腎臟疾病常導致基底膜和系膜區的改變，所以PASM染色質量的好壞對臨床診斷有很大影響[5]。

在臨床工作中發現PASM染色受很多因素的影響。與傳統PASM染色方法相比，改良PASM染色方法降低了六氨銀溶液的硝酸銀、硼酸濃度，使得切片組織在銀染時更溫和，著色更適度，更易于控制，不至于出現染色過深、染色過淺及多余銀顆粒沉積的現象。同時，改良的PASM染色方法調整六氨銀溶液的配制順序，先將硼砂加入六次甲基四胺中，使溶液堿化后再加入硝酸銀，因為堿化的六次甲基四胺硼砂液削弱六次甲基四胺鰲合銀離子的穩定性，使銀離子極易被游離的醛基還原成棕黑色的沉淀[6]，與傳統PASM染色方法相比，改良PASM染色方法較快，而且穩定，適用于臨床推廣。

對于改良PASM染色方法中出現極少數銀染過度、銀染過淺的情況，在工作中還應注意以下重要6點：1)充分氧化組織：腎組織切片需用1%過碘酸充分氧化，保證蛋白多糖充分暴露醛基，進而能夠與銀離子充分結合。2)孵育溫度：孵育溫度是PASM染色最重要的一個環節，經過大量實驗摸索，孵育溫度控制在65℃左右，銀染效果最佳，溫度偏低標本不宜著色，病理玻片會出現多余銀顆粒沉積；溫度偏高則容易導致標本著色過度。3)染液中銀離子濃度：硝酸銀濃度要適中，如果硝酸銀濃度過高不利于染色的控制；硝酸銀濃度過低容易使六氨銀溶液變渾濁，并出現氯化金難以去除的黑色反光膜[4]，致使切片背景較臟不利于診斷。4)孵育時間：切片1 μm厚度，一般在改良的六氨銀染液孵育時間為30 min左右，在孵育的過程中及時觀察，根據個人經驗適時終止孵育，然后根據銀染情況選擇性的用0.1%氯化金分化，以求達到最佳效果。5)所用配液器皿必須保證清潔，無雜質，配液之前充分刷洗，并用蒸餾水沖洗2-3 min。6)為保證配制的試劑染色效果良好、延長試劑使用期限，所用試劑均放在4℃冰箱冷貯。

總之，改良PASM染色能夠收到良好的染色效果，并適合在臨床應用推廣。但同時要控制切片組織的氧化、孵育溫度和孵育時間等因素，才能避免極少數病例銀染過度、過淺和多余銀雜質顆粒沉積等問題。

參考文獻：

[1]婁巖，劉樹軍，高丹，等．改良冷配Schiff染液在腎穿刺活檢病理檢查中的應用[J]．中國實驗診斷學，2014,18(9)：1507.

[2]柳長青，劉樹軍，林萍，等．腎穿刺活檢患者腎臟疾病臨床病理特點-附1600例資料分析[J]．中國實驗診斷學，2013,17(6)：1101.

[3]劉樹軍，周立英，王連有，等．腎臟穿刺病理標本染色方法探討[J]．中國實驗診斷學，2007,11(9)：1242.

[4]戚曉東.腎小球基底膜 PAMS 染色方法的應用體會[J]．診斷病理學雜志，2012，19(2)：159.

[5]呂增華，張楊楊，朱玉紅．腎穿刺活檢六胺銀染色套染 Masson 染色方法的改良[J]．臨床與實驗病理學雜志,2012,28(12):1289.

[6]李繼承主編．組織學與胚胎學實驗技術(第1版)[M].北京：人民衛生出版社，2010:49-51．

收稿日期：(2013-11-19)

文章編號：1007-4287(2015)04-0617-03

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