長枝木霉對白三葉種子發芽及幼苗抗逆性研究

葉 巍，薛應鈺，徐秉良，陳 龍

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

長枝木霉對白三葉種子發芽及幼苗抗逆性研究

葉 巍，薛應鈺，徐秉良，陳 龍

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

在室內條件下，用不同濃度的長枝木霉孢子懸浮液對白三葉種子進行處理，研究了其種子發芽率、根芽長及抗逆性酶活變化，以及長枝木霉對白三葉種子的促生作用及抗逆性的影響。結果表明，長枝木霉孢子懸浮液濃度在5.0×105個/mL～1.0×107個/mL時能促進白三葉種子活性，在孢子濃度為1.0×106個/mL時，發芽率為93%，與對照80%相比提高了16.25%；胚根長1.93 cm，與對照1.26 cm相比增長了53.1%；胚芽長1.33 cm，與對照1.04 cm相比增長了27.8%。抗逆性結果表明，長枝木霉孢子懸浮液能夠提高白三葉種子抗病害及不良環境的能力，降低MDA含量，提高PAL、POD的活性。其中，孢子懸浮液濃度為5.0×105個/mL時，PAL活性最高，為2.157 U/(g·min) FW；孢子濃度為1.0×106個/mL時POD的活性最高，為29.875 U/g FW；孢子懸浮液濃度5.0×105個/mL時，MDA含量最低，為1.012 μmol/g FW。

木霉菌；孢子懸浮液；白三葉；促生作用；抗逆性

白三葉(Trifoliumrepens)作為一種多年生草本豆科植物分布于世界各地，其含有黃酮類、氨基酸、糖類和維生素等多種營養成分[1]，并且白三葉對銅、鉛、鎘等重金屬有富集作用，可為土壤重金屬污染的修復提供科學依據[2，3]。白三葉對土壤要求不嚴，并且由于其具有抗逆性強、蛋白含量高、耐寒、抗旱、管理費用低、株型低矮等優點被廣泛種植[4，5]。雖然白三葉具有多種價值，但隨著白三葉的大面積種植，其病蟲害的危害日趨嚴重[6]。因此，如何提高白三葉的抗性成為生產上亟待解決的問題之一。

木霉菌(Trichodermaspp.)屬半知菌類的絲孢綱(Hyphomycetes)，廣泛存在于森林腐殖質層和農田果園等的土壤中[7]。據不完全統計，木霉菌至少對18屬29種植物病原真菌有拮抗作用，由于其具有廣譜性、適應性強和多機制的特點而被廣泛應用[8]。木霉菌不僅對病原微生物有拮抗作用，而且能直接作用于植物促進其萌發生長和開花，且其本身受外界干擾影響小，因此在植病生防中具有重要的、不可忽視的作用[9]。

已有研究報道了木霉屬菌株可以促進植物種子萌發、植株的生長和開花、提高作物產量等[10]。焦琮等[11]發現康氏木霉(T.koningii)活孢可提高棉花和菜豆種子活力[11]，梁志懷等[12]用哈茨木霉(T.harziznum)發酵液對豇豆種子處理后對其幼苗具有促進作用。程玲娟等[13]用深綠木霉(T.viride)對牧草草種進行處理，證明深綠木霉對牧草草種的發芽有明顯促生作用。張樹武等[14]研究發現，不同稀釋倍數深綠木霉發酵液對白三葉的發芽率、發芽指數、POD、PPO等有明顯的影響[14]。目前，對促生作用研究較多的木霉是哈茨木霉和深綠木霉，而長枝木霉是我國新鑒定的木霉菌種，有關其促生作用和抗逆性研究與利用報道較少。

試驗通過研究不同濃度長枝木霉的孢子懸浮液對白三葉種子的促生效果以及誘導植物抗逆性的影響，為長枝木霉菌劑的開發提供一定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試長枝木霉(T.longibrachiatum)由甘肅農業大學草業學院植物病原學實驗室提供；供試的海發白三葉由蘭州步畝園林公司提供；使用PDA培養基馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌的孢子懸浮液對白三葉種子活力的影響測定方法 孢子懸浮液的制備 首先將PDA培養7 d的長枝木霉孢子用無菌水清洗，配置成濃度為1.0×108個/mL孢子懸浮液備用。

孢子懸浮液對白三葉種子萌發率的測定 先將濃度為1.0×108個/mL的長枝木霉孢子懸浮液分別稀釋成5個濃度梯度(1.0×107、5.0×106、2.0×106、1.0×106、5.0×105個/mL)，以無菌水為對照，共6個處理。在培養皿中放一張大小適宜的濾紙，每個皿中放入飽滿程度基本一致的白三葉種子40粒，每個處理3個重復。再倒入2 mL配好的不同濃度的長枝木霉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，置于25 ℃，12 h/d光照的人工氣候培養箱中培養。此后每天對皿中噴2 mL的無菌水。10 d后，吸干白三葉種子表皮的水分，統計發芽率，用直尺測量胚芽長和胚根長。

1.2.2 白三葉種子抗逆性指標的測定 丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定方法，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法[15，16]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度長枝木霉孢子懸浮液對種子發芽率的影響

長枝木霉孢子懸浮液對白三葉種子發芽率具有明顯的促進作用，與對照相比不同濃度孢子懸浮液對種子發芽率的影響存在顯著的差異。長枝木霉的孢子懸浮液在濃度為1.0×107，5×106和2.0×106個/mL的條件下可抑制白三葉種子的活力，在濃度為1.0×106、5.0×105個/mL下可以促進白三葉種子的活力。孢子懸浮液濃度在1.0×106個/mL下白三葉種子發芽率最高，為93%，與對照(80%)相比增長了16.25%。孢子懸浮液濃度在1.0×107個/mL白三葉種子發芽率最低，為35%，出現了負增長，與對照80%相比增長率為-56.25%。

圖1 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子的發芽率Fig.1 The effect of spore suspension with different concentrations on the seed germination rate

2.2 孢子懸浮液對胚根長與胚芽長的影響

不同濃度長枝木霉孢子懸浮液對白三葉種子的胚根長和胚芽長具有明顯的促進作用。與對照相比胚根長隨孢子濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，當孢子濃度1.0×106個/mL時胚根長為1.93 cm，與對照1.26 cm相比增長了53.17%(表1)。濃度在1.0×106個/mL時胚芽長為1.43 cm，與對照1.05 cm相比增長了36.19%(表2)。

2.3 孢子懸浮液對白三葉種子抗逆性指標的影響

2.3.1 丙二醛(MDA)含量 不同濃度長枝木霉孢子懸浮液對白三葉MDA含量影響存在顯著的差異，與對照相比處理后白三葉MDA含量隨孢子懸浮液濃度的增加而逐漸減小。當孢子懸浮液濃度為5.0×106個/mL時白三葉MDA含量最小，為1.012 μmol/g FW(圖2)。

表1 不同濃度的孢子懸浮液下的萌發種子的胚根長Table1 The effect of spore suspension with different concentrations on the root hair length

表2 不同濃度的孢子懸浮液下種子的萌發胚芽長Table2 The effect of spore suspension with different concentrations on the buds length

圖2 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子MDA含量Fig.2 The effect of spore suspension with different concentrations on MDA content

2.3.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性 PAL的活性隨著長枝木霉孢子懸浮液的濃度變化而變化。在濃度為1.0×107、5.0×106個/mL時PAL活性與對照沒有顯著差異(P<0.05)。當濃度為5.0×105個/mL時，PAL活性與對照相比差異顯著，且達到最大值2.157 U/g·min FW(圖3)。

圖3 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子PAL活性Fig.3 The effect of spore suspension with different concentrations on PAL activity

2.3.3 過氧化物酶(POD)活性 POD的活性隨著長枝木霉孢子懸浮液的濃度變化有明顯的變化。在濃度為1.0×107個/mL時POD活性與對照相比有所降低。隨著濃度的降低POD的活性逐漸上升，當濃度稀釋到1.0×106個/mL時達到最大值29.875 U/g FW，與對照存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子POD活性Fig.4 The effect of spore suspension with different concentrations on POD activity

3 討論與結論

北方地區白三葉的萌發率低，長勢差，因此，促進其萌發和生長是當前面臨的嚴峻問題。近年來Chang[17]通過試驗證實，當用泥土為基質的哈茨木霉培養物或其分生的孢子懸浮液處理土壤后，辣椒、長春花和菊花等植物均會有發芽率提高、開花早而多、鮮重增加的現象。通過哈茨木霉T22和深綠木霉P1比較處理和未處理根的干鮮重、植株地上部分生物量、株高、葉和果實的數量，得出作物產量提高 300%[18]。試驗結果表明，長枝木霉孢子懸浮液在低濃度更能促進生長，在濃度1.0×106個/mL時，對白三葉的發芽率、胚根長和胚芽長的促生效果最明顯。這與劉云龍等[19]研究哈茨木霉對辣椒生長和王建峰等研究木霉發酵產物對黃瓜種子活力的結論基本相同[20]。

PAL對植物產生的木質素等起到一定調節作用，與植物抗病性有關，而POD能將植物所產生的H2O2分解，所以與植物抗逆性有關[21]。不同的孢子懸浮液濃度對白三葉的POD和PAL酶活性有一定的影響，都可作為抗病生理指標，誘導植物產生抗病性。試驗通過不同濃度的長枝木霉菌孢子懸浮處理白三葉種子后，其POD和PAL酶活性發生了明顯變化，抗病性和抗逆性也隨之變化，且在一定范圍內隨孢子懸浮液濃度的增加POD、PAL有所上升，表明適宜濃度處理白三葉種子后可有效提高其抗病性。MDA是膜脂過氧化作用產生的物質，其含量越高說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重，反之則越輕微[21]。長枝木霉菌孢子懸浮液濃度為5.0×106個/mL時，有效的降低了MDA的含量，從而降低白三葉種子的傷害程度，體現出長枝木酶孢子懸浮液在促進植物生長方面的潛能，即在適宜濃度下的長枝木霉孢子懸浮液可以降低對種子的傷害提高植物的抗逆性活力，這將為擴大農業環境中長枝木霉的應用空間、應用范圍提供有效的資源和依據。

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Effect ofTrichodermalongibrachiatumon seed growth and resistance of clover

YE Wei,XUE Ying-yu,XU Bing-liang,CHEN Long

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The effect ofTrichodermalongibrachiatumon seeds growth and resistance of clover was studied by measuring the germination rates,root length and resistance of clover treated with different spores concentrations of T.longibrachiatum.The results showed that the vigor of clover seeds was increased after treated with the concentration of 5.0×105to 1.0×107spores/mL ofT.longibrachiatum.The germination rates,root length,shoot length were 93%,1.93 cm and 1.33 cm after treated with the concentration of 1.0×106spores/mL,and which were increased by 16.25%,53.1% and 27.8% compared to control(80%,1.26 cm,1.04 cm),respectively.The spore suspension ofT.longibrachiatumcould enhance the ability of seeds resistance to plant disease and unfavorable environment.The activity of phenylalanine(PAL) and peroxidase(POD) were increased after treated with the spore suspension,but the activity of methane dicarboxylic aldehyde(MDA) was decreased.The maximum activity of PAL and POD were 2.157 U/g(FW)·min and 29.875 U/g(FW) while the spore suspension concentrations were 5.0×105and 1.0×106spores/mL,respectively.The minimum activity of MDA was 1.012μmol/g(FW) treated with 5.0×106spores/mL.

Trichoderma;spore suspension;clover;growth promoting;resistance

2015-03-15；

2015-04-20

甘肅省高校基本科研業務費(甘財教[2012]129號)項目資助

葉巍(1989-),女,吉林省公主嶺市人，在讀碩士研究生。 E-mail：523133614@qq.com 薛應鈺為通訊作者。

S 541.041

A

1009-5500(2015)04-0049-05