不同消毒劑對甘肅紅豆草種子消毒效果及萌發的影響

董文科，馬暉玲，陳春艷

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

不同消毒劑對甘肅紅豆草種子消毒效果及萌發的影響

董文科，馬暉玲，陳春艷

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

利用正交設計試驗研究了3個不同種子預浸泡時間(6，12和24 h)，3種消毒劑(10% H2O2，30% NaClO和0.1% HgCl2)和3個不同消毒時間(10，20和30 min)對甘肅紅豆草種子萌發率、污染率及發芽指數的影響，以獲取甘肅紅豆草無菌苗時種子的最佳消毒方法。結果表明，3個因素對發芽率影響差異顯著；預浸泡時間對發芽指數影響差異極顯著，而對污染率影響差異不顯著；消毒劑種類及消毒時間對污染率和發芽指數影響差異顯著。綜合各項因素，室溫條件下無菌水預浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min種子發芽率較高，污染率較低，發芽較快且出苗整齊，是獲取甘肅紅豆草無菌苗種子的最佳消毒方式。

消毒劑；紅豆草；萌發；污染

在植物細胞工程試驗中，以無菌種苗作為外植體，獲得愈傷組織和再生植株，進一步進行轉基因操作；為了獲得高質量的RNA，常選擇幼嫩的無菌苗為RNA提取的試驗材料[1]。

甘肅紅豆草(Onobrychisviciaefoliacv.Gansu)屬多年生豆科牧草，是由甘肅農業大學等單位選育出的對甘肅生境有較強適應性的品種[2]。其莖葉茂盛，草質柔嫩，含有豐富的維生素和礦物質，適口性好，各類家畜均喜食[3]，是優質牧草之一[4]。在植物基因工程研究中，紅豆草又作為優良基因的重要來源[5]。所以，紅豆草種子的消毒及無菌苗的培養在植物細胞工程試驗中發揮著十分重要的作用。通過研究不同的消毒劑對甘肅紅豆草種子消毒效果及種子萌發等的影響，為甘肅紅豆草無菌種苗的培養、高效再生體系的建立和優良基因的轉化提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

甘肅紅豆草，由甘肅農業大學草業學院提供。

MS培養基所用的無機鹽、蔗糖以及瓊脂為國產分析純，各種維生素和激素購自上海生工生物有限公司，試驗用水均為蒸餾水。

1.2 試驗方法

將甘肅紅豆草飽滿種子，室溫下，用無菌水預浸泡不同時間后，75%的乙醇浸泡30 s，不同消毒劑浸泡處理，按3因素3水平正交試驗，正交表選用L9(34)[6](表1)，然后用無菌水反復沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干種子表面水分，接種于MS培養基上，每瓶15粒，6 次重復，25 ℃、光照14 h/d(光照強度2000 lx)的恒溫箱下萌發。試驗期間，觀察記錄紅豆草種子發芽與污染情況，發芽數逐日統計，第7 d以后萌發率已基本不變，計算發芽率及發芽指數。

表1 正交試驗L9(34)表頭設計Table1 Orthogonal design

1.3 數據分析

種子發芽率=正常發芽的種子粒數/供試種子總粒數×100%

污染率=染菌株數/總株數×100%

發芽指數(Gi)=ΣGt/Dt

式中：Gt為在時間t日的發芽數，Dt為發芽日數。

以SPSS 19統計學軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 各因素對甘肅紅豆草種子發芽率影響分析

不同因素水平極差(R)的大小，說明該因素對試驗結果的影響程度。各因素對甘肅紅豆草發芽率影響的直觀分析結果表明，不同因素對甘肅紅豆草發芽率影響的主次關系為消毒時間>消毒劑種類>預浸泡時間(表2)。結合方差分析，3個因素對甘肅紅豆草發芽率均有顯著意義(P<0.05)，且影響大小為，消毒時間>消毒劑種類>預浸泡時間，與直觀分析結果一致(表3，4)。對3個因素采用LSD多重比較(表3)，結果表明，不同預浸泡時間對發芽率影響差異顯著，發芽率由高到低為24，12和6 h。消毒劑種類對發芽率影響差異顯著，發芽率由高到低為0.1% HgCl2，30% NaClO和10% H2O2。消毒時間對發芽率影響差異顯著，發芽率由高到低為20 min，10 min和30 min。試驗分析可得，獲得最高發芽率的最優消毒方案為預浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min，紅豆草種子發芽率為67.78%。

2.2 各因素對甘肅紅豆草種子污染率影響分析

各因素對污染率直觀分析(表3)表明，對甘肅紅豆草污染率影響的極差大小為RB>RC>RA，不同因素對甘肅紅豆草污染率影響的主次關系為消毒劑種類>消毒時間>預浸泡時間。結合方差分析(表4)，消毒劑的種類對污染率的差異極顯著(P<0.01)，消毒時間對污染率的差異具有顯著影響(P<0.05)，而預浸泡時間對污染率影響差異不顯著(P>0.05)，3個因素影響大小為消毒劑種類>消毒時間>預浸泡時間，與直觀分析結果一致。對3個因素采用LSD多重比較(表3)，結果表明0.1% HgCl2，30% NaClO和10% H2O2之間對污染率影響差異極顯著；消毒20 min和30 min與消毒10 min之間差異顯著，而消毒20 min和30 min差異不顯著。各項分析比較可得，獲得最低污染率的最優消毒方案為：0.1% HgCl2消毒20 min或30 min，但消毒30 min會使發芽率降低，因此，采用0.1% HgCl2消毒20 min。

表2 正交試驗L9(34)試驗結果Table2 Result of orthogonal experiment

表3 正交設計直觀分析和多重比較Table3 Result of direct analysis and multiple comparison

注：L表示每個水平相同因子的估算邊際平均值，R表示每個因子估算邊際平均值的極差；不同大、小寫字母分別表示0.01水平顯著(F≥F0.01)和0.05水平顯著(F≥F0.05)

2.3 各因素對甘肅紅豆草種子發芽指數影響分析

各因素對發芽指數直觀分析(表3)表明，對甘肅紅豆草發芽指數影響的極差大小為：RA>RB>RC，不同因素對甘肅紅豆草發芽指數影響的主次關系預浸泡時間>消毒劑種類>消毒時間。結合方差分析(表4)，預浸泡時間對發芽指數的影響差異極顯著(P<0.01)，消毒劑的種類和消毒時間對發芽指數影響差異顯著(P<0.05)，3個因素影響大小為預浸泡時間>消毒劑種類>消毒時間，與直觀分析結果一致。對3個因素采用LSD多重比較(表3)，結果表明，預浸泡24 h與預浸泡6 h和12 h之間對發芽指數影響差異顯著；10% H2O2和30% NaClO與 0.1% HgCl2之間對發芽指數影響差異顯著，而10% H2O2和30% NaClO差異不顯著，但從降低污染率考慮，30% NaClO消毒效果優于10% H2O2，因此，常選用30% NaClO；消毒20，30 和10 min之間差異顯著，而消毒20 min和30 min差異不顯著，但從降低污染率考慮，消毒30 min效果優于20 min。因此，獲得較高發芽指數的最優消毒方案為：預浸泡24 h、30% NaClO消毒30 min。

表4 正交試驗方差分析Table4 Result of variance analysis

注：**表示0.01水平顯著(F≥F0.01)，*表示0.05水平顯著(F≥F0.05)

3 討論和結論

試驗中種子消毒，選擇合適的消毒劑和消毒時間是獲得無菌苗的關鍵因素。判斷某種消毒方法是否合適，要綜合考慮發芽率、污染率、發芽勢等因素[7-10]。試驗中得出，3個指標最優方案分別為預浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min發芽率最高；預浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min污染率最低；預浸泡24 h、30% NaClO消毒30 min發芽指數最高。但30% NaClO消毒30 min污染率高達18.89%，而且消毒時間太長會使種子由褐色變為黃色，對種子造成一定損傷[11]。綜合考慮種子萌發情況和污染情況，試驗最佳消毒方案為無菌水預浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min。

研究表明，HgCl2作為消毒劑其消毒效果最好[12]，然而HgCl2可以使蛋白質變性，其對植物的毒性較大。經過HgCl2處理的種子，其發芽率、發芽勢均不高，但這種消毒方法處理操作相對簡便，抑菌效果穩定，所以被廣泛作為較大體積種子的消毒劑[13]。對于紅豆草這種體積較大，并且種皮上附著大量內生真菌的種子[14]，HgCl2消毒是最佳的選擇。

有資料報道，油菜(Brassicanapus)、月季(Rosahvbrida)、生姜(Zingiberofficinale)的外植體除了采用常規的消毒方法外，還有使用抗生素、抗菌素等抑菌藥劑處理外植體，具有一定的抑菌效果[15-17]。至于其他消毒劑對甘肅紅豆草種子的消毒效果和影響，仍有待于進一步研究。

[1] 張玉,李聰,白史且,等.三種不同消毒劑對飼草菊苣種子萌發和生長的影響[J].草業學報,2010(1):253-257.

[2] 陳寶書.紅豆草[M].蘭州：甘肅科學技術出版社,1992.

[3] 朱秀梅,趙永衛.紅豆草種子發芽試驗中防止種子霉爛的探討[J].新疆畜牧業,2007(6)：28-29.

[4] 周萬海,師尚禮,周娟娟.NaCl脅迫對甘肅紅豆草生理特征的影響[J].草原與草坪,2012,32(3)：32-35.

[5] 楊茁萌,陳穎.紅豆草縮合單寧生物合成相關蛋白的研究[J].草食家畜(增刊),1996(9)：47-54.

[6] 蓋鈞鎰.試驗統計方法[M].北京：中國農業出版社,2000：382.

[7] 李建,李建鵬.雷公藤組織培養外植體消毒和選擇[J].中南林業科技大學學報,2010(8):18-21.

[8] Erica E,Benson J,anaher E D.In vitro micropropagation of Primula scotic:a rare Scottish plant[J].Biodiversity and Conservation,2000(9):711-762.

[9] Colgencen O L H,Buyukkartal H N,Toker M C.In vitro germination and structure of hard seed testa of natural tetraploidTrifoliumpratenseL[J].African Journal of Biotechnology,2008,7(10):1473-1478.

[10] 李敏華,張洪溢.無籽西瓜無菌萌發條件的研究[J].海南師范學院學報,2001,14(1):80-83.

[11] 施莉娟,蒲小鵬.種子消毒方法和激素處理對和田大葉紫花苜蓿植株再生的影響[J].草原與草坪,2011,31(1):54-57.

[12] 欒博宇,王洪君.紫花苜蓿無菌苗培養前的消毒技術研究[J].畜牧與飼料科學,2009,30(10):172-173.

[13] 張志元,官春云.油菜無菌苗培養前的種子消毒技術[J].中國油料作物學報,2005,27(3):88.

[14] 陳林,南志標.紅豆草種帶真菌研究[D].蘭州：蘭州大學,2010.

[15] 王志成,劉明稀,易自離.殺菌劑防治植物組織培養的初步研究[J].長沙電力學院學報,2004,19(1):82.

[16] 林森.植物組織培養污染問題的研究及控制措施[J].江蘇農業科技,2005,32(1):28.

[17] 陳麗閔,毛碧增.影響無菌苗體系建立因素的研究進展[J].浙江農業科學,2011(3):483-487.

Effects of different disinfectants on seed sterilization and germination ofOnobrychisviciaefoliacv.Gansu

DONG Wen-ke,MA Hui-ling,CHEN Chun-yan

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

Experiments with orthogonal design were carried out to explore an optimal sterilizing method forOnobrychisviciaefoliaseeds through pre-soaking (6,12,24 h) and different disinfectants (10% H2O2,30% NaClO,0.1% HgCl2) and sterilizing time (10,20,30 min),The germination,contamination rate and germination index of were measured.The results showed that all factors had the significant effects on germination;the pre-soaking time had the most significant effects on germination,but it was not significant on contamination .The disinfectants and sterilizing time had significant effects on contamination and germination .Therefore,the best treatment was pre-soaking in sterilized distilled water for 24 h at room temperature,and then to treat the seed with 0.1% (w/v) aqueous mercuric chloride for 20 min .

disinfectants;Onobrychisviciaefolia;germination;contamination

2014-10-21；

2015-01-04

甘肅省科技廳科技支撐計劃項目(1104 NKCA087)資助

董文科(1990-)，男，甘肅金昌人，在讀碩士。 E-mail：602105125@qq.com 馬暉玲為通訊作者。

S 541

A

1009-5500(2015)02-0080-04